疏水色譜膜分離純化植物源藥物的研究.pdf

1、植物源藥物在疾病治療方面發(fā)揮著越來越重要的作用，并且有著來源廣泛、副作用小和成本低的優(yōu)勢(shì)。目前，植物源藥物活性成分的分離純化主要基于柱色譜技術(shù)，該技術(shù)存在運(yùn)行壓力高、耗時(shí)長(zhǎng)、分離過程常使用大量有機(jī)溶劑等問題。這些問題的存在，不利于植物源藥物的進(jìn)一步開發(fā)利用。膜色譜是一項(xiàng)將膜分離技術(shù)和液相色譜技術(shù)相結(jié)合的新型分離技術(shù)，其分離過程主要依賴液相中不同溶質(zhì)與分離膜之間相互作用強(qiáng)度的差異。因膜色譜分離方法具有運(yùn)行壓力低、分離速度快、易規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)

2、而備受關(guān)注。目前膜色譜技術(shù)主要應(yīng)用于生物大分子，如蛋白、DNA和抗體的分離純化，而在植物源藥物成分純化方面鮮有報(bào)道。
　　本研究將膜色譜分離方法應(yīng)用于植物源藥物的分離純化。與生物大分子不同，植物源藥物一般分子量小、分子所帶電荷少，與分離膜之間靜電相互作用、疏水相互作用力等都較弱，這些特點(diǎn)使得藥物分子不容易被分離膜吸附，難以實(shí)現(xiàn)色譜分離過程。因此強(qiáng)化膜對(duì)植物源藥物提取液中不同成分的相互作用并維持這種相互作用的差異性是膜色譜技術(shù)應(yīng)用于

3、植物源藥物分離純化需要解決的關(guān)鍵問題。氧化石墨烯(GO)具有獨(dú)特的二維平面結(jié)構(gòu)、巨大的表面積、離域大π鍵結(jié)構(gòu)，這些特點(diǎn)使其成為理想的吸附材料。迄今已有諸多研究報(bào)道將功能化GO用作低水溶性癌癥治療藥物的載體，為解決此類藥物給藥難題提供了新的思路。在GO負(fù)載抗癌藥物時(shí)，藥物分子與GO之間通過疏水相互作用和π-π共軛作用(Hydrophobic interaction andπ-πinteraction)形成強(qiáng)有力的物理結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)高載藥量

4、和緩釋功能。受此啟發(fā)，本研究將GO偶聯(lián)到膜基材上作為疏水相互作用位點(diǎn)，強(qiáng)化分離膜對(duì)植物源藥物提取液中相關(guān)成分的吸附性能，為色譜分離創(chuàng)造先決條件。為此，制備了GO改性的棉纖維(GO-CF)，將其制成疏水相互作用分離膜，研究該分離膜的性能并應(yīng)用于多酚、鞣花酸(EA)和丹參素(DSS)等植物源藥物色譜分離純化，從而為植物源藥物的分離純化建立一種運(yùn)行壓力低、快速，而且不使用有機(jī)溶劑、安全環(huán)保的疏水相互作用膜色譜(HIMC)方法。
　　主要

5、內(nèi)容如下:
　　1.氧化石墨烯改性棉纖維分離膜的制備與表征
　　以棉纖維(CF)為基材，將GO以共價(jià)鍵的方式接枝到棉纖維上，提供強(qiáng)疏水吸附位點(diǎn)，將GO改性棉纖維制成片狀分離膜。SEM、Raman、FT-IR和XPS測(cè)試表明，GO通過環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)接枝到CF上。以石榴皮粗提液中多酚的純化為考察對(duì)象，研究了膜的基本性能。所得結(jié)果表明，跨膜壓降會(huì)隨著流速的增加而增加，但其膜壓降(40～160kPa，0.5～5.0ml·min-1)顯

6、著低于經(jīng)典的商用色譜柱，表明本研究的色譜膜運(yùn)行過程更節(jié)能;經(jīng)多次吸附-脫附循環(huán)，跨膜壓降未發(fā)生顯著變化，說明分離膜具有良好的可重復(fù)使用性。對(duì)于石榴皮多酚的純化，純水和0.04MNaOH水溶液分別適宜作為吸附階段和洗脫階段的流動(dòng)相。多酚主要通過疏水相互作用吸附到膜上，增強(qiáng)流動(dòng)相溶液的堿性，導(dǎo)致多酚分子中的酚羥基解離、水合作用增強(qiáng)，減弱了多酚分子與膜之間的疏水相互作用，從而實(shí)現(xiàn)脫附?；诜迕娣e比(Elution peak/flow-thro

7、ugh peak)計(jì)算結(jié)果，GO改性棉纖維膜對(duì)多酚的吸附量約是未改性棉纖維膜的140倍，證實(shí)了GO改性對(duì)提升棉纖維基色譜膜性能的顯著效果。經(jīng)過一次吸附-脫附循環(huán)，可除去石榴皮提取液中約72.5％的多糖和幾乎所有的蛋白，而多酚含量從48.0％提高到約76.1％，多酚回收率達(dá)73.0％左右。
　　2.藥物在膜色譜中相對(duì)保留時(shí)間估算方法的建立
　　由于生物大分子和小分子藥物在分子量、分子結(jié)構(gòu)、電荷密度等方面的顯著差異，現(xiàn)有描述生物

8、大分子與色譜膜之間疏水相互作用的理論無法有效預(yù)測(cè)藥物分子在疏水色譜膜上的保留行為。針對(duì)這一問題，本研究選擇親疏水性有顯著差異的一系列藥物作為模型化合物，研究其在反相高效液相色譜(HPLC)模式下的相對(duì)保留時(shí)間(tRR)與模型化合物親水基團(tuán)比率(HGR)之間的關(guān)系，建立了經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?tRR=1.06-0.52HGR-1.16(HGR)2，R2=0.96，水/乙腈流動(dòng)相)。并且，考查了洗脫梯度和有機(jī)溶劑的種類對(duì)tRR的影響。結(jié)果表明，tRR與

9、洗脫梯度陡度無關(guān)而與流動(dòng)相有機(jī)溶劑的種類有關(guān)，極性大的有機(jī)溶劑對(duì)應(yīng)更長(zhǎng)的相對(duì)保留時(shí)間。根據(jù)目標(biāo)藥物的結(jié)構(gòu)計(jì)算其HGR，可判斷目標(biāo)藥物的相對(duì)親疏水性，并計(jì)算其tRR，據(jù)此推斷其在HIMC的相對(duì)保留時(shí)間順序，從而快速確定收集目標(biāo)藥物成分的適宜時(shí)機(jī)，并為設(shè)計(jì)色譜膜分離運(yùn)行方案提供指導(dǎo)。
　　3.疏水相互作用膜色譜提純鞣花酸和丹參素
　　為克服目前用于鞣花酸和丹參素分離純化的柱色譜法所存在的運(yùn)行壓力高、分離速度慢和使用大量有機(jī)溶劑的

10、缺點(diǎn)，本研究采用所制備的GO-CF疏水色譜膜對(duì)EA粗品和DSS粗品進(jìn)行純化，考察了適宜的HIMC運(yùn)行模式和運(yùn)行條件?；趯?duì)相對(duì)保留時(shí)間tRR的估算，對(duì)于疏水性較強(qiáng)的EA，提出并實(shí)施了為吸附-脫附(Binding-elution mode)運(yùn)行模式，即:雜質(zhì)透過分離膜，而在洗脫階段收集目標(biāo)組分;對(duì)于親水性的DSS，采用直接透過(Flow through)運(yùn)行模式，即在吸附階段收集目標(biāo)組分，而雜質(zhì)在洗脫階段排出膜組件。系統(tǒng)考察了流動(dòng)相溶液組

11、成、pH、流速等因素對(duì)藥物純化效果的影響，所得結(jié)果表明:5mM Na2CO3溶液和0.04M～0.06MNaOH溶液分別適宜作為EA粗品分離純化的吸附相溶液和洗脫相溶液，對(duì)于GO接枝量為0.4wt.％的改性棉纖維膜，經(jīng)一次吸附-脫附循環(huán)，EA純度從7.5％(原始提取液)提高到75.0～80.0％，該分離膜對(duì)EA的吸附量達(dá)到397.8μg·ml-1(根據(jù)膜體積)，換算成GO的吸附量為GO吸附了自身質(zhì)量27.5％的EA，與文獻(xiàn)報(bào)道的功能化G

12、O作為藥物載體時(shí)對(duì)藥物的吸附載藥量相近。綜合考慮DSS的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性，5mMpH6的磷酸鈉緩沖溶液和0.04M NaOH溶液分別適合作為DSS粗品純化的吸附相溶液和洗脫相溶液。通過一次吸附-脫附循環(huán)，DSS的純度由24.8％(原始提取液)提高到70.0～75.0％，此純度高于文獻(xiàn)報(bào)道的吸附樹脂柱色譜法(57.3％)和離子交換樹脂柱色譜法(71.1％)，而且DSS的回收率可達(dá)96.0％。對(duì)于DSS粗品的純化是通過分離膜吸附雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成