玄參和黃連的化學(xué)成分分離及其生物活性研究.pdf

1、玄參為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的根。重慶市南川區(qū)目前已成為全國(guó)最大的玄參種植基地，是全國(guó)玄參的重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)。黃連屬毛莨科黃連CoptischinensisFranch.的根。黃連為重慶石柱縣的地道中藥材。
　　 為了更好的開發(fā)利用玄參和黃連的藥用價(jià)值，發(fā)展當(dāng)?shù)刂兴幃a(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)，本文對(duì)玄參和黃連進(jìn)行了化學(xué)成份和生物活性研究。本研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.提取分離實(shí)驗(yàn)
　　 1.

2、1玄參化學(xué)成分的分離
　　 取玄參根，粉碎，用70％的乙醇滲漉提取，再經(jīng)D101大孔樹脂分離洗脫為30％，60％和90％乙醇的三部分。此三部分利用硅膠柱層析、HSCCC色譜等手段從玄參中分離出9個(gè)化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu)確定為哈巴苷、桃葉珊瑚苷、類葉升麻苷、升麻素苷、蔗糖、肉桂酸、哈巴俄苷、安格洛苷C和二十七烷。其中60％乙醇部分，用高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)在氯仿-正丁醇-甲醇-水(4∶1∶3∶2)體系中分離，首次同時(shí)分

3、離出高純度哈巴俄苷(98％)和安格洛苷C(98.5％)，此為這兩化合物分離提供了一條新的簡(jiǎn)單容易分離手段。
　　 1.2黃連化學(xué)成分的分離
　　 本實(shí)驗(yàn)采用HSCCC法，在CHCl3-MeOH-0.2MHCl(4∶1.5∶2)體系中分離黃連浸膏，直接一步分離出小檗堿（純度為80.56％）、黃連堿（純度為82％）、藥根堿（純度為82％）、巴馬?。兌葹?8％）及表小檗堿(純度為85.65％)，各單一斑點(diǎn)的流分再分別過Sep

4、hadexLH-20柱純化，以氯仿/甲醇系統(tǒng)洗脫，可分別得到純度較高的5個(gè)生物堿(98％)。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 2.1體外的降糖活性初步研究
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)玄參和黃連化學(xué)成分的降糖活性初步研究，選擇用HepG2細(xì)胞。從玄參中分離得到的各浸膏組分和化合物均能在不同程度上促進(jìn)HepG2細(xì)胞中葡萄糖消耗。過大孔樹脂分離的60％乙醇組分為玄參降糖活性的主要活性部位。在0.1μg/ml～2.5μg/ml濃度范圍內(nèi)，

5、篩選玄參和黃連中的各個(gè)化合物的降糖活性，以小檗堿的葡萄糖消耗能力最高，對(duì)促進(jìn)HepG2細(xì)胞中葡萄糖消耗具有一定的劑量依賴關(guān)系;哈巴俄苷和黃連堿對(duì)促進(jìn)HepG2細(xì)胞中葡萄糖消耗相對(duì)較好。
　　 2.2ⅡepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧清除實(shí)驗(yàn)
　　 采用高糖刺激的方法來建立ROS模型，用熒光法測(cè)定，依據(jù)藥物的熒光強(qiáng)度值和抑制率的結(jié)果可知，玄參和黃連中化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧都有抑制作用，只是抑制的程度不同。在1～10μg/ml的藥物濃度時(shí)

6、，與高糖組相比，化合物中的小檗堿和黃連堿有較好的抗氧化活性，其在一定濃度下能夠較好的抑制高糖刺激的活性氧升高，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系;同時(shí)，黃連中分離的生物堿比玄參中的化合物的抗氧化能力基本上要強(qiáng)。
　　 2.3玄參化學(xué)成分對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用
　　 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinconvertingenzyme，ACE）在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中具有調(diào)控血壓的作用。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC

7、)的方法測(cè)定ACE-HHL-ACEI反應(yīng)體系產(chǎn)物Hip，計(jì)算抑制率，驗(yàn)證玄參的降壓機(jī)制是否與抑制ACE活力相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，考察玄參中各化合物在同一濃度(2mg/ml)下，加入不同體積（體積X為30、60和120μl）對(duì)ACE活性的抑制作用。結(jié)果表明各化合物在同一濃度加入不同體積對(duì)ACE活性的抑制作用有劑量關(guān)系，加入體積越大，抑制效果越好，但與卡托普利的抑制作用相比，玄參中各化合物在此濃度下的ACE活力的抑制率明顯較低(P＜0.01)，說明

8、玄參中各化合物降壓效果一般。
　　 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 3.1黃連的化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍保護(hù)作用的研究
　　 本實(shí)驗(yàn)考察了黃連中的5個(gè)生物堿和8-烷基小檗堿衍生物(8-BBR-Cn，n=4，8，12和16)對(duì)大鼠胃潰瘍保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 在無水乙醇致胃黏膜損傷性模型中，與模型對(duì)照組相比，大鼠胃黏膜損傷指數(shù)和抑制率的考察結(jié)果可知，表小檗堿、巴馬汀和藥根堿(25、50、100mg/kg)均無明顯的抑制

9、乙醇誘導(dǎo)的大鼠急性胃黏膜損傷。而西咪替?。?0mg/kg，陽性對(duì)照組），黃連堿、小檗堿和8-烷基小檗堿衍生物(25、50、100mg/kg)均能顯著的抑制乙醇誘導(dǎo)的大鼠急性胃黏膜損傷(P＜0.001)。對(duì)胃黏膜的前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮合酶(NOS)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，黃連堿、小檗堿和8-烷基小檗堿衍生物對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用可能是通過PGE2和NOS的通路來調(diào)節(jié)改善，而8-十六烷基小檗堿可明顯抑制乙醇誘導(dǎo)的大鼠急性

10、胃黏膜損傷(P＜0.001)，其抑制效果最好。
　　 幽門結(jié)扎法復(fù)制大鼠胃潰瘍模型中，與模型對(duì)照組相比，黃連堿、小檗堿和8-烷基小檗堿衍生物(25、50、100mg/kg)能顯著減少其胃液量、降低胃液總酸度和胃蛋白酶活性(P＜0.001)，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。灌胃給藥100mg/kg的黃連堿、小檗堿和8-烷基小檗堿衍生物也可顯著抑制H+K+-ATP酶活力(P＜0.05，P＜0.01)，其結(jié)果是抑制由于幽門結(jié)扎手術(shù)引起的胃酸分泌過

11、多，從而使藥物對(duì)胃潰瘍有保護(hù)作用。在影響NO上，各給藥組(25、50、100mg/kg)均顯著促進(jìn)NO生成(P＜0.05，P＜0.01)。在影響MDA上，黃連的化合物中僅有黃連堿對(duì)幽門結(jié)扎型消化性潰瘍大鼠MDA的抑制有顯著的作用(P＜0.01)。
　　 3.2大鼠長(zhǎng)期食用黃連中的巴馬汀對(duì)其體重調(diào)節(jié)和性別偏好的影響
　　 在實(shí)驗(yàn)90天考察中，各組大鼠每10天稱體重1次，根據(jù)體重調(diào)節(jié)給藥量。與空白雌性大鼠對(duì)照組的體重相比，食

12、用巴馬汀(100mg/Kg)的雌性大鼠在50天后體重明顯增加(P＜0.05);在60-90天內(nèi)，食用巴馬汀的雌性大鼠的體重顯著增加(P＜0.01)。與空白雄性大鼠對(duì)照組的體重相比，食用巴馬汀(100mg/Kg)的雄性大鼠體重在40-70天內(nèi)明顯減少(P＜0.05)，而80-90天大鼠體重顯著降低(P＜0.01)。所以，巴馬汀在大鼠體重有性別選擇的調(diào)節(jié)作用。通過檢查血液學(xué)的參數(shù)，雌激素水平和分析腎組織中UCP2表達(dá)(免疫印跡法)的方法來驗(yàn)