一、歸巢肽修飾的外泌體靶向缺氧-復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞二、人食道癌相關(guān)基因4在心肌缺血-再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　一、歸巢肽修飾的外泌體靶向缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞
　　目的：外泌體是由細(xì)胞膜兩次內(nèi)陷形成的直徑約40-120nm的囊泡，是體內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞之間通訊及物質(zhì)交換的重要途徑。外泌體避免了其它傳統(tǒng)基因運(yùn)送載體（質(zhì)粒、病毒、脂質(zhì)體等）的諸多缺陷：如載體毒性，失靶現(xiàn)象，低效基因運(yùn)送，體內(nèi)快速清除，生物半衰期短，引起炎癥、免疫反應(yīng)，致瘤性等。外泌體具有天然、穩(wěn)定、良好的生物分布、相容性、及低免疫源性等特

2、性。此外，外泌體可穿過(guò)生物屏障并能夠攜帶單一或隨意組合的治劑等優(yōu)點(diǎn)。天然未經(jīng)修飾的外泌體經(jīng)系統(tǒng)給藥后，會(huì)優(yōu)先分布于肝、腎、脾等器官而被很快清除。利用基因工程可以將歸巢肽展示在外泌體表面，從而增加外泌體在體內(nèi)的滯留時(shí)間，加速所攜帶藥物向靶器官運(yùn)送的速度，并增加藥物在靶器官的濃度。由于外泌體在形成過(guò)程中選擇性的富集來(lái)源細(xì)胞的各種信號(hào)分子，且外泌體的組成可以反應(yīng)來(lái)源細(xì)胞的生理及病理狀態(tài)，因此，外泌體已被廣泛用于許多疾病包括心血管疾病的診斷、治

3、療及預(yù)防。本研究旨在前期構(gòu)建的攜帶有靶向缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞能力的歸巢肽質(zhì)粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP2b-CSTSMLKAC)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討經(jīng)基因工程修飾后的外泌體是否可以將歸巢肽展示在外泌體表面，及該外泌體是否具有靶向缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的能力，從而為缺血性心臟病的靶向治療提供一種全新的、理想的運(yùn)送載體。
　　方法：HEK293T細(xì)胞上通過(guò)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染攜帶具有靶向缺氧/

4、復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞能力的歸巢肽質(zhì)粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP-2b-CSTSMLKAC)和攜帶FLAG標(biāo)簽的對(duì)照質(zhì)粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP-2b-DY-KDDDDK)，48小時(shí)后收取細(xì)胞培養(yǎng)基，采用差速超速離心法提取細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體。通過(guò)電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析儀、Western blot方法對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定;免疫沉淀技術(shù)證明FLAG標(biāo)簽是否成功的展示在外泌體表面;利用胰酶聯(lián)合Ⅱ

5、型膠原酶兩步法分離培養(yǎng)原代乳大鼠心肌細(xì)胞，加入250μM氯化鈷共同培養(yǎng)12小時(shí)，然后正常培養(yǎng)2小時(shí)復(fù)制心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）模型;采用qPCR檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1A的表達(dá)及乳酸脫氫酶試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的活性對(duì)H/R-CMs模型進(jìn)行鑒定;熒光染料（紅色熒光）標(biāo)記靶向外泌體并分別加入正常的乳大鼠心肌細(xì)胞及缺氧/復(fù)氧的心肌細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)外泌體的分布情況。
　　結(jié)果：

6、(1)電鏡下差速超速離心法分離得到的外泌體大小在100nm左右，具有球型的膜性結(jié)構(gòu)，Western blot顯示該外泌體為CD9和CD63蛋白陽(yáng)性，并且非外泌體標(biāo)志蛋白GRP94和Calnexin陰性;納米顆粒跟蹤分析儀示顯示外泌體直徑集中在50-100nm;(2)免疫沉淀結(jié)果顯示FLAG標(biāo)簽成功的展示在了外泌體表面。(3)氯化鈷共同培養(yǎng)的心肌細(xì)胞相比正常心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1A的表達(dá)水平明顯上調(diào)(p＜0.01);H/R-CMs組細(xì)胞

7、培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的活性比正常心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的活性明顯升高(P＜0.01);(4)細(xì)胞免疫熒光示H/R-CMs中分布了較多的紅色熒光，而正常心肌細(xì)胞中未見(jiàn)紅色熒光。
　　結(jié)論：靶向缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的歸巢肽成功地展示在外泌體表面，經(jīng)修飾后的靶向外泌體具有靶向缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的能力。
　　二、人食道癌相關(guān)基因4在心肌缺血/再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究
　　目的:探討人食道癌相關(guān)基因4(Ecrg4)在心肌

8、缺血/再灌注損傷中的作用及其機(jī)制。
　　方法:采用結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支及分離培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)氯化鉆處理分別建立體內(nèi)及體外水平的心肌缺血/再灌注損傷模型，實(shí)時(shí)熒光定量PCR, Western blot及免疫組化檢測(cè)Ecrg4在心肌缺血/再灌注損傷后表達(dá)水平的變化。熒光素酶活性檢測(cè)ECRG4啟動(dòng)子對(duì)缺氧的反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR C qPCR)法檢測(cè)心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá) Ecrg4后在發(fā)生缺氧/復(fù)氧損傷后炎癥相關(guān)基因(IL1,CD

9、44,NF-KB)及凋亡相關(guān)基因(Bcl2及Bax)表達(dá)水平的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)Ecrg4后心肌細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果:1.qPCR,Western blot及免疫組化顯示Ecrg4在心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生后其表達(dá)水平快速下調(diào);2.ECRG4基因啟動(dòng)子(EP400)-304到-300含有的經(jīng)典缺氧反應(yīng)元件(HRE)，對(duì)氯化鉆誘導(dǎo)的缺氧高度敏感。HIZE突變后(EP404mut)明顯減低該啟動(dòng)子對(duì)氯化鉆誘導(dǎo)的缺

10、氧反應(yīng)，HIF-1A顯著抑制了EP400的啟動(dòng)子活性，而EP400mut則喪失了對(duì)HIF-lA的反應(yīng)性(p<0.01);3.心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)Ecrg4后炎癥相關(guān)基因(IL 1, CD44, NF-KB)表達(dá)明顯下調(diào)及抗凋亡基因Bcl2表達(dá)上調(diào)，促凋亡基因Bax下調(diào)(p<0.5);4.流式細(xì)胞分析顯示過(guò)表達(dá)Ecrg4后心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降。
　　結(jié)論:1.Ecrg4在心臟對(duì)缺氧的反應(yīng)性中起重要的作用;2.Ecrg4在心肌缺血/再灌注