益氣養(yǎng)陰方對(duì)阿霉腎病大鼠腎小球?yàn)V過屏障的影響.pdf

1、原發(fā)性腎病綜合征(PNS)是兒童時(shí)期的常見病,以微小病變型腎病綜合征(MCNS)為主要病理類型,約占80％左右。雖然大部分患兒對(duì)腎上腺糖皮質(zhì)激素治療效果滿意,但是仍有少部分患兒對(duì)激素治療抵抗或頻繁復(fù)發(fā),甚至可能發(fā)展到慢性腎衰或死亡。
　　 鑒于此,臨床上一直在尋求既能提高激素療效,又能減輕激素副作用的新藥物和新方法。而多年來,中醫(yī)藥在小兒腎臟病(包括腎病綜合征)治療中取得了一定的進(jìn)展。盡管多年來人們對(duì)于中醫(yī)藥治療兒童原發(fā)性腎病綜

2、合征進(jìn)行了多方面的研究,但迄今為止中醫(yī)藥治療該病的機(jī)制仍然不清。
　　 近年來,研究者圍繞著腎小球?yàn)V過屏障的功能障礙,特別是足細(xì)胞的損傷,深入探討了參與蛋白尿發(fā)生的多種因素。腎小球?yàn)V過屏障的完整性決定著其對(duì)蛋白質(zhì)的選擇通透性,腎小球基底膜中的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)對(duì)濾過膜維持電荷屏障起關(guān)鍵作用。乙酰肝素酶(heparanase,HPA)為β-D-內(nèi)切糖苷酶,可以選擇性降解腎小球基底膜HS側(cè)鏈,在蛋白

3、尿發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。同樣,nephrin作為足細(xì)胞裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)的重要組分參與構(gòu)成濾過膜機(jī)械屏障,既往研究表明其與腎病綜合征等多種腎臟疾病蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)。益氣養(yǎng)陰方是近年來我院臨床常用于輔助治療兒童腎病的協(xié)定處方,取得了一定的效果。本研究擬以微小病變型腎病綜合征的動(dòng)物模型為對(duì)象,在蛋白和基因水平觀察研究大鼠腎組織中HPA和ncphrin的表達(dá)和變化,探討益氣養(yǎng)陰方對(duì)阿霉素腎病大鼠的腎小球?yàn)V過

4、屏障的影響及其機(jī)制研究。
　　 第一部分
　　 益氣養(yǎng)陰方對(duì)阿霉素腎病大鼠的影響
　　 目的：觀察益氣養(yǎng)陰方對(duì)阿霉素腎病模型大鼠24h尿蛋白排泄量、各項(xiàng)生化指標(biāo)以及腎臟病理的變化,以研究益氣養(yǎng)陰方對(duì)阿霉素腎病模型的影響。
　　 方法：(1)阿霉素腎病大鼠動(dòng)物模型的建立。雄性SpraLgue-Dawley(SD)大鼠,共30只,隨機(jī)分為5組,每組6只,分為正常對(duì)照組、模型組和干預(yù)組益氣養(yǎng)陰方組、干預(yù)組激素組

5、和干預(yù)組益氣養(yǎng)陰+激素組。體重110-130g。實(shí)驗(yàn)組給予一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素5mg/kg;對(duì)照組給予尾靜脈注射等量生理鹽水。在阿霉素注射后7天、14天、21天及28天分別收集24小時(shí)尿,第28天處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠。(2)常規(guī)生化方法測(cè)定大鼠24小時(shí)尿蛋白定量及血脂、腎功能等生化指標(biāo);光鏡和電鏡下觀察大鼠腎臟病理改變。(3)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。組間比較采用One-Wa

6、y ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：(1)微小病變型腎病綜合征動(dòng)物模型的建立:在注射阿霉素后第14天出現(xiàn)大量蛋白尿(330.4±198.6,P＜0.01),血清白蛋白明顯減少(9.55±3.90,＜0.01),總膽固醇(1.63±0.44,P＜0.01)和甘油三酯(1.35±0.11,P＜0.05)明顯增高,以上各項(xiàng)指標(biāo)均在第28天達(dá)高峰。腎組織電鏡觀察顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠于阿霉素注射后28天足突廣

7、泛融合。(2)模型組與各干預(yù)組的比較:益氣養(yǎng)陰方組、激素組和益氣養(yǎng)陰方+激素組干預(yù)28天后,蛋白尿排泄量下降,血清白蛋白升高,膽固醇和甘油三酯降低,尤以益氣養(yǎng)陰方+激素組干預(yù)組最為明顯。(3)組織形態(tài)學(xué)研究:腎組織電鏡觀察顯示,各干預(yù)組阿霉素注射后28天腎小球足細(xì)胞足突部分融合較模型組均有輕,尤以益氣養(yǎng)陰方+激素組最為明顯,未見明顯足突融合。
　　 小結(jié)：益氣養(yǎng)陰方可能通過減輕模型大鼠腎小球足細(xì)胞足突損傷,減少阿霉素腎病大鼠尿蛋

8、白的排泄,尤以益氣養(yǎng)陰+激素組保護(hù)效果更為顯著。
　　 第二部分
　　 益氣養(yǎng)陰方對(duì)大鼠腎臟乙酰肝素酶和足細(xì)胞nephrin蛋白的影響
　　 目的：分別研究各組阿霉素腎病大鼠腎組織HPAmRNA和尿中HPA濃度的表達(dá),以及腎組織nephrin mRNA和nephrin蛋白表達(dá)變化,以探討益氣養(yǎng)陰方對(duì)大鼠腎臟基底膜及其足細(xì)胞相關(guān)分子的影響。
　　 方法：(1)研究對(duì)象采用在第一部分建立的微小病變型腎病綜合征

9、動(dòng)物模型(阿霉素腎病大鼠),分組情況和取材時(shí)間同第一部分。(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,檢測(cè)各組28天后腎組織HPAmRNA的表達(dá);采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),檢測(cè)各組鼠尿中HPA濃度。采用免疫組織化學(xué)染色,半定量和定位檢測(cè)nephrin蛋白的表達(dá);免疫組化圖像分析采用Motie image3.2圖像分析軟件進(jìn)行分析。(3)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-X±s)表示。組間比較采用One-W

10、ay ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗(yàn)。用Pearson法分析HPA變化與蛋白尿的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)28天后,模型組大鼠腎組織HPAmRNA表達(dá)(4.55±0.38),明顯高于正常對(duì)照組腎組織HPAmRNA表達(dá)(1.50±0.79),兩組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);而其他各組中,益氣養(yǎng)陰方組(3.56±0.18)和益氣養(yǎng)陰+激素組(3.13±0.81)較模型組HPAmRNA表達(dá)量少,有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其中,尤以益氣養(yǎng)陰+激素組減少量最顯著(3.13±0.81)。并且HPA在腎臟中的表達(dá)量與24h尿蛋白量呈顯著正相關(guān)(r=0.708,P＜0.005)。(2)實(shí)驗(yàn)28天后,模型組大鼠尿中HPA濃度要高于正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而其他3組干預(yù)組,尿中HPA濃度均低于模型組,高于正常組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)腎組織nephrin mRNA水平的表達(dá):與正常對(duì)照組(0.93±0.07)相比,模型組腎臟n

12、ephrin mRNA(1.04±0.11)表達(dá)升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而益氣養(yǎng)陰方組、激素組和益氣養(yǎng)陰方+激素組的表達(dá)都不同程度的下降,分別為(0.96±0.11、0.92±0.02和0.91±0.01)接近正常組表達(dá),尤以激素組、益氣養(yǎng)陰+激素組下降明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)各組大鼠腎組織nephrin平均面密度比(即nephrin蛋白陽性表達(dá)面積與視野總面積百分比)表達(dá)結(jié)果正好相反。與正常對(duì)照組(23.

13、77±4.50)相比,模型組腎臟nephrin平均面密度比明顯下降(15.1±1.42,P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而其他干預(yù)后各組nephrin平均面密度比,與模型組比較均有升高(分別為16.96±1.00、18.49±1.60和19.90±3.30);除益氣養(yǎng)陰+激素組升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其他兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(5)各組大鼠腎小球nephrin蛋白平均面密度比與大鼠24 h尿蛋白之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66,P＜0

14、.05)。
　　 小結(jié)：(1)結(jié)果顯示益氣養(yǎng)陰方組、激素組、益氣養(yǎng)陰+激素組均能影響腎臟HPA表達(dá),表明益氣養(yǎng)陰方可能通過降低腎臟HPA表達(dá),以保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障中GBM的完整性,從而實(shí)現(xiàn)降低蛋白尿。(2)同時(shí)結(jié)果也顯示,Nephrin的變化和蛋白尿發(fā)生存在著密切關(guān)系;同時(shí),益氣養(yǎng)陰方組、激素組、益氣養(yǎng)陰+激素組均能影響腎臟nephrin表達(dá),并且以益氣養(yǎng)陰+激素組最為顯著;這表明益氣養(yǎng)陰方降低蛋白尿的機(jī)制之一,可能與調(diào)節(jié)腎臟n

15、epbxin的表達(dá)有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.益氣養(yǎng)陰方可以通過減輕模型大鼠腎小球足細(xì)胞足突損傷,減少阿霉素腎病大鼠尿蛋白排泄,以益氣養(yǎng)陰+激素組保護(hù)效果更為顯著。
　　 2.益氣養(yǎng)陰方可能通過抑制腎臟HPA,從而保護(hù)GBM完整性,維持了濾過膜電荷和機(jī)械屏障,最終使蛋白尿減低。
　　 3.益氣養(yǎng)陰方組可能通過調(diào)節(jié)足細(xì)胞SD中的nephrin蛋白表達(dá),來維持保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障,以降低蛋白尿的發(fā)生發(fā)展。并