烏賊墨多糖干預(yù)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)睪丸氧化應(yīng)激損傷的Nrf2-ARE調(diào)控機制研究.pdf

1、目前,研究已證實烏賊墨多糖(SIP)是一類具有廣泛生物學(xué)功能的海洋生物活性物質(zhì),可用于食品、保健及醫(yī)療等領(lǐng)域。本實驗室研究人員長期致力于研究 SIP的化療預(yù)防作用,發(fā)現(xiàn)該功能具有廣譜高效等特性,不僅能有效保護心、肺、肝、脾等內(nèi)臟器官,也能降低環(huán)磷酰胺(CP)對睪丸的毒性損傷。本研究旨在探討SIP干預(yù)CP介導(dǎo)睪丸氧化應(yīng)激損傷的作用效果及其相關(guān)機理。
　　首先,本實驗通過酶提醇沉方法從烏賊墨中分離得到粗多糖樣品,然后經(jīng)柱層析純化多糖樣

2、品,并測定純多糖的純度、分子量及紅外分析。經(jīng)分離純化得到單一的洗脫多糖樣品,該樣品重均分子量為37068Da。純度鑒定顯示在260nm及280nm處無吸收峰,說明不含蛋白質(zhì)及核酸等雜質(zhì)。高效液相色譜圖譜分析顯示只有一個峰,且峰形較對稱,峰寬較窄,說明該樣品較純。紅外分析顯示擁有多糖特征吸收峰和硫酸根基團特征吸收峰。
　　60只健康的雄性昆明小白鼠,隨機分為6組。實驗周期10周,檢測小鼠生殖器官指數(shù)、精子參數(shù)、睪丸組織切片及雄性生殖

3、能力。實驗結(jié)果顯示 CP能導(dǎo)致雄性生殖損傷,與前人研究結(jié)果相一致。CP組,小鼠體重、睪丸重量及附睪重量顯著(p<0.01)降低,睪丸指數(shù)顯著(p<0.05)下降,附睪指數(shù)差異不顯著(p>0.05);精子數(shù)、精子存活率顯著(p<0.05)下降,各種畸形精子數(shù)及精子畸形率顯著(p<0.05或p<0.01)提高;睪丸組織損傷嚴(yán)重,各階段生精細(xì)胞數(shù)量減少,尤其是初級生精細(xì)胞,各曲細(xì)精管間間隙增加,睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷,曲細(xì)精管直徑顯著(p<0.01

4、)減小;雄性生殖能力下降,雌性小鼠受孕率降低,每窩胎兒數(shù)和活胎率顯著(p<0.01)降低,死胎兒率顯著(p<0.01)升高,畸形胎兒率變化不顯著(p>0.05)。與模型組相比,SIP治療組除在精子數(shù)、中尾折角精子數(shù)及畸形胎兒率無顯著(p>0.05)改善,其他各指標(biāo)都有明顯改善(p<0.05或p<0.01),說明SIP能干預(yù)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)睪丸生殖損傷的作用效果。
　　40只健康的雄性昆明小白鼠,隨機分為4組,空白組、模型組、烏賊墨多糖

5、組、治療組。實驗周期10周,處死小鼠,檢測睪丸組織中標(biāo)志性酶活力、血清中性激素水平及氧化應(yīng)激損傷等相關(guān)指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示與模型組相比,SIP顯著(p<0.05或p<0.01)改善CP導(dǎo)致睪丸中標(biāo)志性酶活力的異常變化,如LDH活力顯著(p<0.05)上升,AKP、ACP及γ-GT活力顯著(p<0.05或p<0.01)下降,且LDH、ACP及γ-GT活力與空白組無顯著(p>0.05)差異;改善 CP介導(dǎo)血清及睪丸中性激素水平的異常變化,血清

6、中FSH、E和LH水平顯著(p<0.05或p<0.01)降低,血清及睪丸中T水平顯著(p<0.01)提高;緩解CP導(dǎo)致雄性小白鼠睪丸組織氧化應(yīng)激損傷,如環(huán)磷酰胺處理組MDA及NO含量顯著(p<0.01)升高,抗氧化酶SOD、CAT、GR、GSH-PX及二相解毒酶GST活力顯著(p<0.01)下降,抗氧化劑GSH及Vc含量顯著(p<0.01)下降,總抗氧化能力顯著(p<0.01)降低,即說明SIP能顯著(p<0.05或p<0.01)提高抗

7、氧化酶活力及抗氧化劑含量,降低MDA及NO含量,緩解睪丸組織氧化應(yīng)激損傷。
　　40只健康的雄性昆明小白鼠,分組處理如上。實驗周期10周,處死小鼠,提取睪丸組織中總蛋白。采用蛋白質(zhì)印記分析睪丸組織中與氧化應(yīng)激 Nrf2/ARE信號通路相關(guān)的調(diào)控基因及下游目的基因相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果顯示與空白組相比,CP組Nrf2,Keap1和NQO1表達水平明顯(p<0.05或p<0.01)降低,HO-1,HDAC2和p-PKC表達水平無顯著

8、(p>0.05)改變,SIP顯著(p<0.05或p<0.01)提高Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、HDAC2及p-PKC表達水平。與模型組相比,SIP顯著(p<0.01)緩解CP導(dǎo)致Nrf2、Keap1、NQO1表達水平的降低,說明SIP能通過激活Nrf2/ARE信號通路來緩解CP導(dǎo)致睪丸氧化應(yīng)激損傷,且Keap1,HDAC2及p-PKC參與調(diào)控Nrf2/ARE信號通路。
　　SIP能有效地緩解CP導(dǎo)致雄性生殖損傷的作用

9、。其緩解機制與它改善睪丸組織標(biāo)志性酶活力和氧化還原的穩(wěn)態(tài),及維持血清及睪丸組織中性激素水平平衡有關(guān)。另外,SIP的抗氧化作用在它緩解CP導(dǎo)致雄性生殖損傷方面起到重要作用,一方面它作為強的抗氧化劑,可以直接清除睪丸內(nèi)因 CP作用產(chǎn)生的過量活性氧自由基,維持睪丸組織氧化還原的穩(wěn)態(tài);另一方面它作為氧化誘導(dǎo)劑,間接激活 Nrf2/ARE信號通路,促進下游抗氧化酶及二相解毒酶等蛋白表達,來抵抗外界不利因素。其中它能通過氧化Keap1上巰基調(diào)控激活