脂聯(lián)素通過血管外膜干預(yù)脂多糖介導(dǎo)的氮氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脂聯(lián)素受體在血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)的研究
　　 本研究的目的：1探討脂聯(lián)素受體在血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞上的表達(dá)情況；2在炎癥狀態(tài)下，血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素受體的變化。通過這一研究，為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素通過血管外膜發(fā)揮抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：1細(xì)胞培養(yǎng)：剝脫小鼠胸主動(dòng)脈的外膜，用組織貼塊法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到80-90融合時(shí)傳代，實(shí)驗(yàn)采用第4-8代細(xì)胞。分別用α-SM-ac

2、tin單抗(1：200)和波形蛋白(Vimentin)單抗(1：300)和二抗TRITC(1：100)進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否是所需要的AF及其純度。2實(shí)驗(yàn)分組：
　　 (1)根據(jù)LPS的刺激濃度分組
　　 (2)根據(jù)LPS的不同刺激時(shí)間分組
　　 3 RT-PCR：觀察正常血管外膜組織、骨骼肌組織及肝組織脂聯(lián)素受體的表達(dá)及正常及LPS刺激后，血管外膜成纖維細(xì)胞(AFs)上AdipoR1及Adi

3、poR2的表達(dá)，采用“2-△△CT方法”分析基因的表達(dá)量。
　　 4蛋白印跡分析：觀察正常血管外膜組織、骨骼肌組織及肝組織脂聯(lián)素受體的表達(dá)及正常及LPS刺激后，AFs上AdipoR1及AdipoR2的表達(dá)。強(qiáng)弱用表達(dá)的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。
　　 5免疫細(xì)胞熒光染色：觀察正常及LPS刺激后，F(xiàn)ITC和TRITC二抗標(biāo)記的α-SM-actin、vimentin、AdipoR1及AdipoR2在AF中

4、的表達(dá)，用IOD比較它們?cè)诓煌纸M間表達(dá)的強(qiáng)弱。
　　 結(jié)果：
　　 1 AF的孵育和鑒定：
　　 2脂聯(lián)素和脂聯(lián)素受體的表達(dá)：
　　 3 LPS刺激下脂聯(lián)素受體1的表達(dá)：
　　 創(chuàng)新性及局限性：
　　 1.創(chuàng)新點(diǎn)
　　 (1)應(yīng)用RT-PCR、western blot及免疫細(xì)胞熒光等多種方法證實(shí)了血管外膜成纖維細(xì)胞上存在著脂聯(lián)素受體，尤其是脂聯(lián)素受體1，在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。

5、　　 (2)在LPS刺激下，血管外膜成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體1表達(dá)降低，呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　 2.局限性
　　 (1)因技術(shù)所限，未能對(duì)脂聯(lián)素受體進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。
　　 (2)未對(duì)脂聯(lián)素受體在炎癥刺激下表達(dá)降低的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。
　　 結(jié)論：
　　 (1)正常血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞可以表達(dá)脂聯(lián)素受體，其中脂聯(lián)素受體1高表達(dá)，脂聯(lián)素受體2低表達(dá)，而血管外膜成纖維細(xì)胞幾乎不表達(dá)脂

6、聯(lián)素。提示脂聯(lián)素可能通過旁分泌途徑作用于血管外膜成纖維細(xì)胞。
　　 (2)血管外膜成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體1的表達(dá)量與LPS刺激濃度和時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。
　　 背景：
　　 本研究目的：1探討脂聯(lián)素對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞遷移、增殖及肌化的影響；2探討脂聯(lián)素對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞iNOS、ONOO-及NO的影響；3探討脂聯(lián)素發(fā)揮上述作用的可能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究結(jié)果將為更深入地研究脂聯(lián)素對(duì)血管的作用途徑和

7、作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　 90只10-12周齡的雄性apoE-/-小鼠實(shí)驗(yàn)全程高脂飲食喂養(yǎng)。
　　 1.2血清脂聯(lián)素濃度分析：利用大鼠抗人脂聯(lián)素ELISA試劑盒分析高脂飼料apoE-/-小鼠轉(zhuǎn)染腺病毒前后血清脂聯(lián)素濃度。
　　 1.3 AS斑塊的超聲影像學(xué)形態(tài)特征：應(yīng)用顯微超聲技術(shù)測(cè)量斑塊面積。
　　 1.4生化指標(biāo)檢測(cè)

8、：取實(shí)驗(yàn)前后全部動(dòng)物眼球后采血，測(cè)定血脂濃度。
　　 1.5一氧化氮生成檢測(cè)：取實(shí)驗(yàn)前后全部動(dòng)物眼球后采血，測(cè)定血清中一氧化氮濃度。
　　 1.6病理學(xué)檢測(cè)：頸動(dòng)脈斑塊組織學(xué)切片分別行蘇木素一伊紅染色，免疫組織化學(xué)染色觀察iNOS和ONOO-的局部表達(dá)。
　　 2體外實(shí)驗(yàn)：
　　 2.1細(xì)胞培養(yǎng)：同論文I。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)分組
　　 2.2.1根據(jù)APN的刺激濃度分組
　　 2.

9、2.2根據(jù)有無siRNA-AdipoR1轉(zhuǎn)染及AMPK抑制劑分組
　　 2.3 siRNA干擾AF AdipoR1蛋白表達(dá)的檢測(cè)：western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞β-actin， AdipoR1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 2.4 MTT試驗(yàn)：觀察APN和LPS刺激后，AF在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖能力。
　　 2.5劃痕法和transwell法：觀察APN和LPS刺激后，AF在不同時(shí)間點(diǎn)的遷移能力。
　　 2.

10、6一氧化氮生成檢測(cè)：觀察APN和LPS刺激后，AF生成一氧化氮的變化。
　　 2.7 RT-PCR:觀察APN和LPS刺激后，iNOS和β-actin的表達(dá)，采用“2-ΔΔCT方法”分析基因的表達(dá)量。
　　 2.8蛋白印跡分析：觀察APN和LPS刺激后，iNOS、nitrotyrosine、p-AMPK、p-ACC和β-actin的表達(dá)。強(qiáng)弱用表達(dá)的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。
　　 2.9免疫

11、細(xì)胞熒光染色：觀察APN和LPS刺激后，F(xiàn)ITC和TRITC二抗標(biāo)記的α-SM-actin在AF中的表達(dá)，用IOD比較它們?cè)诓煌纸M間表達(dá)的強(qiáng)弱。
　　 結(jié)果：
　　 1體內(nèi)試驗(yàn)
　　 1.1動(dòng)物的基本特征
　　 1.2血清脂聯(lián)素濃度
　　 1.3 AS斑塊影像學(xué)特征
　　 1.4脂聯(lián)素對(duì)血脂的影響
　　 1.5脂聯(lián)素對(duì)血清N0的影響與轉(zhuǎn)染前和外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP比較，NO濃度

12、明顯降低。
　　 1.6脂聯(lián)素對(duì)血管壁iNOS和ONOO-的影響與轉(zhuǎn)染前和外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP比較，iNOS和ONOO-的表達(dá)明顯降低。
　　 2體外實(shí)驗(yàn)
　　 2.1 AF的孵育和鑒定：同論文I。
　　 2.2 siRNA干擾AF AdipoR1蛋白表達(dá)的效果應(yīng)用不同濃度siRNA-AdipoR1轉(zhuǎn)染AF進(jìn)行RNAi，western blot檢測(cè)AdipoR1的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染濃度的增加逐漸減低，而β-a

13、ctin的表達(dá)不受影響。
　　 2.3 APN和LPS對(duì)AF增殖的影響
　　 (1)LPS對(duì)AF增殖的影響：通過MTT試驗(yàn)證實(shí)，與正常細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS促進(jìn)AF的增殖。
　　 (2)APN對(duì)AF增殖的影響：通過MTT試驗(yàn)進(jìn)行OD值的比較，APN不影響正常AF細(xì)胞的增殖能力。與LPS組相比，APN+LPS組0D值下降。與APN+LPS組相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+A

14、PN+LPS組0D值升高。
　　 2.4 APN和LPS對(duì)AF遷移的影響
　　 (1)LPS對(duì)AF遷移的影響：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS導(dǎo)致的AF的遷移能力逐漸增加。
　　 (2)APN對(duì)AF遷移的影響：與LPS組相比，APN+LPS組AF遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)減少。
　　 2.5 APN和LPS對(duì)AF向MF轉(zhuǎn)化的影響
　　 (1)LPS對(duì)AF向MF轉(zhuǎn)化的影響：與正常細(xì)胞相比，LP

15、S導(dǎo)致AFα-SM-actin單抗染色陽性的細(xì)胞數(shù)逐步增加。
　　 (2)APN對(duì)AF向MF轉(zhuǎn)化的影響：與LPS組相比，APN+LPS組AFα-SM-actin單抗染色陽性的細(xì)胞數(shù)減少。
　　 2.6 APN和LPS對(duì)AF一氧化氮生成的影響
　　 (1)LPS對(duì)AF一氧化氮的影響：正常情況下，AF產(chǎn)生少量的一氧化氮；加入LPS刺激后，AF一氧化氮的產(chǎn)生增加。
　　 (2)APN對(duì)AF一氧化氮的影響：與LP

16、S組相比，APN+LPS組AF產(chǎn)生的N0減少。
　　 2.7 APN和LPS對(duì)AF iNOS和ONOO-表達(dá)的影響：
　　 與LPS組相比，APN+LPS組AFiNOS和ONOO-的表達(dá)降低(P均＜0.01)。與APN+LPS組相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS組.和Compound C+APN+LPS組AFiNOS和ONOO-的表達(dá)升高(P均＜0.01)。
　　 2.8 AF一氧化氮產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

17、通路通路的影響：
　　 與LPS組相比，APN+LPS組和APN組AF的p-AMPK和p-ACC的表達(dá)增加(P均＜0.01)。與APN+LPS組相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+APN+LPS組AF的p-AMPK和p-ACC的表達(dá)降低(P均＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1血管外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后血清血脂水平下降，體重減輕，說明脂聯(lián)素可通過外膜局部干預(yù)發(fā)揮改善代謝

18、的作用。
　　 2血管外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后，血清過度增高的NO濃度明顯下降，血管壁iNOS和ONOO-表達(dá)降低。提示脂聯(lián)素可能通過抑制iNOS和ONOO-的表達(dá)來發(fā)揮外膜抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　 3體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LPS對(duì)AF的遷移、增殖和肌化均有促進(jìn)作用，而APN能夠有效地抑制LPS對(duì)AF的遷移、增殖和肌化的促進(jìn)作用。
　　 4體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS能夠激活A(yù)F的iNOS，使NO和ONOO-產(chǎn)生增加，而APN