苔類植物兩個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子和一個(gè)甲氧基轉(zhuǎn)移酶的功能研究.pdf

1、苔類植物在植物進(jìn)化史上具有特殊的地位，在適應(yīng)陸地生活的過程中產(chǎn)生了豐富的次級代謝產(chǎn)物，包括聯(lián)芐和黃酮、萜類、木脂素和香豆素等化合物。聯(lián)芐類化合物主要存在于苔類植物中，其生物活性多種多樣，涉及藥用價(jià)值范圍極廣，漸漸成為天然藥物研究以及新藥前導(dǎo)化合物開發(fā)的熱點(diǎn)。類黃酮的種類和功能多樣，對植物自身生長發(fā)育和人類健康都具有十分重要的意義。類黃酮的存在最早起源于苔蘚，在苔類植物中聯(lián)芐類化合物和類黃酮是共同存在的。類黃酮生物合成途徑起源于苯丙烷途徑

2、，通過同位素標(biāo)記法證明聯(lián)芐類化合物的合成途徑也起源于苯丙烷途徑。在苔類植物中兩種化合物共存，共用其合成途徑的上游基因，包括與合成直接相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子。類黃酮生物合成途徑在高等植物中研究比較深入，許多關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控類黃酮合成的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被克隆和鑒定。在擬南芥中被歸為第Ⅲf亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子是經(jīng)典的調(diào)控類黃酮合成的轉(zhuǎn)錄因子，如AtTT8。這類bHLH轉(zhuǎn)錄因子在其他植物中也多有報(bào)道，如葡萄中的VvMYC1、矮

3、牽牛PhAN1、玉米ZmIN1等。
　　本文從苔類植物鈍鱗紫背苔（Plagiochasma appendiculatum）和楔瓣地錢（Marchantia emarginata）的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中分別篩選出兩個(gè)注釋為bHLH家族的基因，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因與AtTT8、VvMYC1同源性較高，具有典型的Basic-Helix1-Loop-Helix2結(jié)構(gòu)域，與Ⅲf亞族bHLH歸為一族，分別命名為PabHLH1和MebHLH1。通

4、過3’-RACE獲得了PabHLH1的基因全長序列信息，并成功地從鈍鱗紫背苔和楔瓣地錢的cDNA中克隆得到了PabHLH1和MebHLH1的ORF序列。利用酵母單雜實(shí)驗(yàn)證實(shí)PabHLH1和MebHLH1都具有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，其轉(zhuǎn)錄活性區(qū)位于基因N-端。利用煙草瞬時(shí)表達(dá)研究基因亞細(xì)胞定位結(jié)果表明PabHLH1和MebHLH1定位于細(xì)胞核，表明其在細(xì)胞核中發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。將兩個(gè)基因分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體pGWB5中，利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥

5、，使PabHLH1和MebHLH1在擬南芥中過表達(dá)。RT-PCR檢測PabHLH1和MebHLH1均成功的整合到擬南芥基因組中，且能正常的表達(dá)。PabHLH1在擬南芥中過表達(dá)可以使結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS、CHI、F3H、 DFR和FLS的表達(dá)水平上調(diào)，類黃酮含量明顯增加，說明PabHLH1在擬南芥中能夠調(diào)控類黃酮化合物的合成。木質(zhì)素含量分析表明PabHLH1轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量與對照組沒有明顯的變化，但間苯三酚染色顯示MebHLH1可

6、能上調(diào)了木質(zhì)素的合成。PabH LH1轉(zhuǎn)化鈍鱗紫背苔葉狀體，其基因轉(zhuǎn)錄水平與聯(lián)芐化合物成分的變化呈正比，表明PabHLH1可調(diào)控聯(lián)芐化合物的合成。苔類轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定對闡述高等植物分化前的生物合成途徑具有重要的生物學(xué)意義，也為提高天然產(chǎn)物活性成分提供了新的候選基因。
　　黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的多樣性也歸功于骨架形成后的結(jié)構(gòu)后修飾，如甲基化、糖基化以及?；揎椀?。黃酮的結(jié)構(gòu)修飾增加了黃酮化合物生理性能的多樣性，也改變了類黃酮的某些化

7、學(xué)性質(zhì)。其中，甲氧基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferases，OMTs)可以將黃酮化合物結(jié)構(gòu)上的羥基甲基化，增加了黃酮的疏水性，使黃酮類化合物的細(xì)胞膜穿透性增強(qiáng)，有利于腸道吸收及在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。本文從鈍鱗紫背苔cDNA文庫中篩選并克隆得到了一個(gè)甲氧基轉(zhuǎn)移酶，命名為PaF6OMT。該酶具有鎂離子依賴性，屬于ClassⅠ OMT，與小鼠兒茶酚OMT同源性比較高，在進(jìn)化樹上與RnCatOMT聚為一簇。酶活結(jié)果表明PaF6OMT的最