抗腫瘤化合物異丹葉大黃素Isorhapontigenin通過JNK-AP-1依賴的Sestrin2上調介導人膀胱癌細胞自噬的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　自噬(autophagy)是一個降解和回收大分子和細胞器的分解代謝過程，通常在壓力條件下被激活。自噬首先由雙層膜泡結構的自噬體形成開始，然后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后在自噬溶酶體中溶酶體水解酶消化囊泡中回收的內容物。自噬體形成是一個三步過程：啟動階段；自噬小體的形成與延伸階段；白噬溶酶體的成熟與降解階段。
　　自噬在細胞中通常保持基礎水平，以維持細胞合成代謝及分解代謝平衡，而當細胞遭遇營養(yǎng)缺

2、乏、缺氧等各種應激時，自噬作為促存活機制被激活。自噬在細胞中受到了多種因子和信號通路的精密調節(jié)，且與凋亡及其他細胞活動有著密切聯系?？焖偕L腫瘤的微環(huán)境常出現低氧、高酸和缺乏營養(yǎng)等情況，當腫瘤細胞面對諸如此類的不利因素，特別是使用化療藥物殺傷腫瘤細胞后，自噬可能通過自噬分解受損傷細胞器及蛋白維持細胞穩(wěn)態(tài)。
　　某些抗腫瘤藥物可以誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬，并參與自噬的分子調控，同時自噬也可能導致腫瘤細胞凋亡?？鼓[瘤藥物引起腫瘤細胞發(fā)生的

3、自噬與藥物的種類和濃度、腫瘤細胞的類型及藥物作用于腫瘤細胞的時間等因素有關。根據自噬的特點，藥物誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬后會產生兩大類不同的結果：一類是保護細胞免受周圍環(huán)境造成的損害；另一類是激發(fā)細胞主動性啟動II型細胞死亡程序。雖然目前對于這兩種不同結果的產生還沒有發(fā)現特定的規(guī)律，但在癌癥治療過程中，各種常規(guī)化療藥物結合自噬抑制劑的組合療法，已被廣泛應用并成為一個有吸引力且有前途的方法。在癌癥治療中此種組合療法的優(yōu)勢在于可以增強惡性腫瘤對

4、化療藥物的敏感性，同時也有一個基本前提，即自噬在這些化學治療的抗癌作用中發(fā)揮保護劑作用。有研究表明，自噬至少有4種功能形式，可能會發(fā)生在對化療藥物中的反應中，具體方式與癌細胞系類型和化療藥物的種類有關。這4種功能形式分別是：細胞保護作用，細胞生長抑制作用，細胞毒性作用和無保護作用。因此，在自噬誘導類抗腫瘤藥物應用于臨床試驗前，明確其誘導自噬的功能類型，并進一步確定其作用機制是非常必要的。
　　閉苞買麻藤是一種中草藥，生長在中國云南

5、省的西南部，用于治療關節(jié)炎， 支氣管炎，心腦血管系統(tǒng)疾病和包括膀胱癌在內的一些癌癥，已有數百年歷史。異丹葉大黃素Isorhapontigenin（ISO）是從中草藥閉苞買麻藤中分離出的一種新的芪類衍生物。因為天然低聚芪具有包括抗癌活性在內的多方面生物學特性，研究人員給予其越來越多的關注。我們之前的研究表明，ISO能夠通過多種機制誘導腫瘤細胞生長抑制和凋亡。如ISO可以通過下調抗凋亡蛋白XIAP表達誘導多種人類腫瘤細胞系的凋亡反

6、應，也能夠抑制膀胱癌細胞增殖，下調細胞周期蛋白Cyclin D1表達，誘導G0/G1期細胞周期阻滯，抑制細胞的遷移能力。然而，很少有研究涉及ISO對腫瘤細胞的自噬誘導作用及其分子機制。
　　Sestrin2（SESN2）是編碼 Sestrin家族 PA26相關蛋白的成員之一，它在抑制氧化應激和AMPK-mTOR信號通路的調控中起著重要作用。SESN2蛋白也參與不同壓力條件細胞活力的復雜調節(jié)。本研究中我們發(fā)現，ISO處理能有效誘導S

7、ESN2依賴性自噬，并且該自噬是 ISO誘導的癌癥細胞非貼壁克隆生長抑制所必需的，這表明對人膀胱癌細胞來說，ISO誘導的自噬是發(fā)揮細胞生長抑制作用的。我們還發(fā)現，SESN2在人膀胱癌組織中顯著下調，動物實驗結果表明，ISO處理組與BBN誘導膀胱癌組的小鼠比較，其膀胱組織中SESN2蛋白表達升高。本課題研究的目的是在已有的研究基礎上，深入探討抗腫瘤化合物 ISO介導腫瘤細胞自噬的分子機制，為ISO的抗癌特性提供新的分子基礎。
　　研

8、究內容及方法：
　　1、通過Western blotting方法檢測ISO作用后不同腫瘤細胞自噬標志性蛋白LC3的蛋白表達變化，初步了解ISO誘導自噬的劑量和程度；檢測ISO處理后自噬通路蛋白的表達水平；檢測與SESN2啟動子區(qū)結合的轉錄因子的蛋白表達情況；檢測C-JUN顯性負突變體TAM67過表達及shC-JUN UMUC3與其相應對照細胞株中磷酸化C-JUN、SESN2和LC3的表達差異；檢測UMUC3/Hela shJNK1

9、和Nonsense對照細胞中ISO處理后Phospho-JNK T183/Y185、JNK、phospho-C-JUN S63、C-JUN、SESN2和LC3表達的變化；檢測人膀胱癌組織及癌旁組織中SESN2的表達差異。
　　2、通過PolyJet細胞轉染法建立穩(wěn)定轉染GFP-LC3的細胞株，應用免疫熒光法觀察GFP-LC3的點狀聚集，驗證ISO的自噬誘導效應；建立shBECN1和shSESN2穩(wěn)定轉染細胞株，在轉染shRNA的腫

10、瘤細胞株中觀察自噬通路蛋白表達被抑制后對ISO誘導自噬的影響；建立TAM67過表達UMUC3細胞株，構建并轉染熒光素酶報告基因質粒SESN2-luc，用熒光素酶報告基因檢測法檢測UMUC3 TAM67和vector對照細胞中ISO誘導的AP-1和SESN2啟動子的轉錄活性的變化；建立穩(wěn)定轉染shJNK1的UMUC3細胞株，轉染熒光素酶報告基因質粒SESN2-luc，用熒光素酶報告基因檢測法檢測SESN2啟動子轉錄活性的變化。
　　

11、3、用Anchorage-independent growth assay觀察自噬抑制劑BAF對ISO誘導的細胞克隆形成抑制的影響；比較UMUC3 shRNA SESN2與Nonsense對照細胞中ISO處理后對細胞克隆形成的影響；比較UMUC3 TAM67過表達、shC-JUN及shJNK1 UMUC3細胞株與相應對照細胞株中ISO處理對細胞克隆形成的影響。
　　4、通過RT-PCR檢測SESN2 mRNA水平的變化；檢測 TA

12、M67過表達、shJNK1 UMUC3細胞株與對照細胞株中ISO處理后SESN2 mRNA水平的變化。
　　5、用染色質免疫沉淀法(ChIP)檢測轉錄因子C-JUN與SESN2啟動子序列的特異性結合作用。
　　6、用免疫組化法(IHC)觀察BBN誘導膀胱癌小鼠組織SESN2蛋白表達情況。
　　研究結果：
　　一、ISO可誘導人腫瘤細胞發(fā)生自噬
　　1、ISO處理可誘導人膀胱癌細胞系UMUC3，T24T及人宮

13、頸癌Hela細胞系發(fā)生自噬，表現為隨著ISO劑量的增加，自噬的標志物LC3-I向LC3-II的轉化也增加。
　　2、ISO處理穩(wěn)定轉染 GFP-LC3的UMUC3細胞，用熒光顯微鏡可以觀察到GFP-LC3點狀聚集以劑量依賴的方式逐漸增多。
　　3、自噬抑制劑BAF可以使ISO處理導致的LC3-II蛋白水平及GFP-LC3點狀聚集進一步增加，表明ISO能夠增加自噬流；BAF也可以明顯削弱ISO對UMUC3細胞非貼壁克隆生長的抑

14、制效應。
　　二、ISO通過刺激自噬相關基因SESN2高表達誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬
　　1、對于UMUC3細胞，自噬誘導劑量的ISO處理可增加Beclin1和SESN2的表達水平。然而，穩(wěn)定轉染shRNA Beclin1的UMUC3細胞未能阻斷ISO誘導的LC3的轉換，穩(wěn)定轉染shRNA SESN2的UMUC3細胞卻使ISO引起的LC3轉化明顯減弱。
　　2、在shRNA SESN2 UMUC3與Nonsense UMU

15、C3對照細胞中觀察ISO對腫瘤細胞非貼壁克隆生長的影響。在Nonsense對照細胞中5μM和10μM ISO處理能明顯減少腫瘤細胞克隆形成；而在shRNA SESN2轉染細胞中，ISO對細胞克隆形成沒有明顯影響。
　　三、C-JUN在ISO誘導SESN2表達及腫瘤細胞生長抑制中起重要作用
　　1、ISO處理以劑量依賴性方式增加 SESN2 mRNA的表達；同時，ISO處理后SESN2轉錄活性也增強。
　　2、對 ISO

16、處理后 SESN2近端啟動子區(qū)多個轉錄因子的表達變化進行 Western Blotting分析，磷酸化NFκB，總NFκB，SP-1和E2F1的表達水平在ISO作用后沒有改變或只顯示輕微改變，而C-JUN的活性形式——磷酸化C-JUN表達被明顯上調。
　　3、C-JUN顯性負突變體TAM67過表達可以明顯阻斷ISO誘導的AP-1的活性和SESN2啟動子活性，同時，RT-PCR和熒光素酶報告基因檢測分析進一步揭示了TAM67能有效阻

17、止SESN2在轉錄水平的升高。
　　4、染色質的免疫沉淀實驗表明SESN2啟動子可與轉錄因子C-JUN相互作用并結合，且這種相互作用在ISO處理后增強。
　　5、轉染TAM67過表達或shC-JUN質粒均可顯著降低ISO處理引起的C-JUN磷酸化、SESN2誘導表達和LC3-II的形成，并抑制ISO處理導致的UMUC3細胞集落形成減少。
　　四、JNK是ISO誘導C-JUN依賴的SESN2激活的上游通路激酶
　　

18、1、ISO誘導C-JUN激活以及LC3-II升高的同時也觀察到JNK激活。shRNA JNK1不僅阻斷了ISO引起的C-JUN活化，同時也減弱了SESN2的誘導升高并抑制了LC3-II的形成；shRNA JNK1也可以完全阻斷ISO處理后SESN2 mRNA的誘導，及SESN2啟動子活化。
　　2、在UMUC3 shJNK1和Nonsense對照細胞中觀察ISO對細胞非貼壁克隆形成的影響：Nonsense對照細胞中5μM和10μM

19、 ISO處理能明顯減少克隆形成；而在shJNK1轉染細胞中，ISO處理對細胞克隆形成沒有明顯影響。
　　五、人膀胱癌組織中SESN2表達減弱，ISO可調節(jié)小鼠癌組織SESN2表達增強
　　1、在人膀胱癌組織樣品中，癌組織與相鄰的正常膀胱組織比較，SESN2表達下調明顯甚至表達缺失。
　　2、在BBN誘導的小鼠浸潤性膀胱腫瘤模型中，ISO+BBN組小鼠與BBN組小鼠相比，SESN2蛋白水平在小鼠膀胱組織中顯著升高。

20、>　　結論：
　　1、亞致死劑量的ISO處理可誘導人腫瘤細胞系發(fā)生劑量依賴性自噬現象，且自噬與ISO引起的腫瘤細胞非貼壁克隆生長抑制有關。
　　2、ISO誘導的自噬具有SESN2依賴性，ISO可增加SESN2 mRNA表達，同時增強SESN2的轉錄活性。
　　3、ISO誘導的自噬需激活JNK/ C-JUN通路，ISO通過調節(jié)轉錄因子C-JUN與SESN2啟動子序列的AP-1結合位點結合，誘導SESN2轉錄激活，并進一步