亞低溫對(duì)腦缺血再灌注小鼠線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白Drp1的影響.pdf

1、目的:
　　通過(guò)阻斷C57BL6小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備小鼠前腦缺血再灌注模型，開(kāi)放血管造成再灌注損傷后，即刻全身噴灑75％的酒精降低小鼠體溫至32-34℃，實(shí)現(xiàn)小鼠亞低溫。HE染色及TUNEL染色檢測(cè)缺血再灌損傷后小鼠海馬組織病理學(xué)形態(tài)且評(píng)估腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的變性情況及低溫療效，免疫組化及western blot檢測(cè)線粒體分裂依賴動(dòng)力相關(guān)蛋白(Dynamin-related protein1，Drp1)和細(xì)胞色素C(Cytochro

2、me C，CytC)蛋白的表達(dá)。揭示缺血再灌注損傷介導(dǎo)線粒體分裂相關(guān)凋亡途徑激活與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，亞低溫對(duì)腦缺血再灌注損傷C57BL6小鼠中線粒體凋亡途徑的影響，探討亞低溫腦保護(hù)的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　健康清潔青年雄性C57BL6小鼠96只，周齡8-12周。采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為3組，每組32只(n=32):假手術(shù)組（S組）、常溫腦缺血再灌注損傷組(NT組)、亞低溫腦缺血再灌注損傷組(H

3、T組)。
　　2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒁约皝喌蜏氐膶?shí)施
　　所有C57BL6小鼠術(shù)前禁食8小時(shí)，飲水自如，記錄體重。小鼠麻醉后，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈兩血管阻斷法制備C57BL6小鼠前腦缺血再灌注模型，腦缺血15min后開(kāi)放血流制造腦缺血再灌注損傷。對(duì)假手術(shù)組（S組）的小鼠只單純分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不予血管夾閉;亞低溫組（HT組）于再灌注即刻向小鼠全身噴灑75％酒精行體表降溫，維持直腸溫度32～34℃4h后實(shí)行復(fù)溫。
　　3.實(shí)驗(yàn)

4、組織樣本提取及檢測(cè)方法
　　3.1HE染色
　　分別于再灌注后24、72h（T1-4）時(shí)，各組隨機(jī)取4只小鼠，麻醉后用手術(shù)剪剪開(kāi)胸廓并且于心尖處插入細(xì)針，以0.9％氯化鈉灌注，再以4％多聚甲醛溶液灌流固定小鼠腦細(xì)胞，待小鼠唇色發(fā)白，全身僵直，尾巴翹起后即表示灌注成功，隨后即刻斷頭取腦分離海馬與皮質(zhì)組織，用4％多聚甲醛溶液中固定標(biāo)本，于4℃保存。固定石蠟包埋，蘇木精染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)結(jié)果，HE染色法觀察海馬組織形態(tài)。

5、r>　　3.2TUNEL染色法
　　分別于再灌注后24、72h(T1-4)時(shí)，各組隨機(jī)取4只小鼠，開(kāi)胸灌注固定，隨后斷頭處死，取標(biāo)本，步驟同上，用TUNEL試劑盒檢測(cè)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，顯微鏡下觀察TUNEL染色結(jié)果，統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)。
　　3.3免疫組化法觀察海馬CA1區(qū)Drp1及Cyt C的表達(dá)
　　各組各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取4只小鼠，同HE染色步驟，斷頭處死，取海馬組織。用免疫組化法觀察海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)

6、Drp1蛋白及Cyt C蛋白的表達(dá)。
　　3.4免疫印跡(Western Blot)法測(cè)定海馬區(qū)Drp1及Cyt C蛋白的表達(dá)水平
　　分別于再灌注后3，6，24、72h（T1-4）時(shí)，隨機(jī)取4只小鼠，將小鼠麻醉后，冰上快速取小鼠腦的海馬組織，置于凍存管內(nèi)妥善密封，為防止蛋白迅速降解，必須即刻迅速放入液氮罐保存標(biāo)本，-80℃冰箱做長(zhǎng)時(shí)間保存。用免疫印跡Western Blot方法測(cè)定海馬Drp1及Cyt C蛋白的表達(dá)水平。<

7、br>　　結(jié)果:
　　1.與假手術(shù)組（S組）相比，常溫缺血再灌注損傷組（NT組）HE染色顯示海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列形態(tài)紊亂，核固縮，胞漿深染;TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加（P＜0.05）;亞低溫缺血再灌注損傷組（HT組）明顯減輕腦缺血組織病理學(xué)，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞正常存活細(xì)胞較NT組明顯增多，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;2.與假手術(shù)組（S組）相比，缺血再灌注損傷組（NT組）的海馬區(qū)Dr

8、p1及Cyt C蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）;與缺血再灌注損傷組（NT組）比較，亞低溫缺血再灌注損傷組（HT組）海馬Drp1及Cyt C蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.亞低溫可以明顯減輕小鼠前腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況，具有腦保護(hù)作用;
　　2.常溫下腦缺血再灌注損傷可促使小鼠海馬線粒體分裂動(dòng)力相關(guān)蛋白Drp1及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)明顯增加;
　　3.亞低溫可