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文檔簡介
1、流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),早產(chǎn)兒成年后可能易患心血管疾病、糖尿病和肥胖等。因此,防治早產(chǎn)是優(yōu)生優(yōu)育的重要一環(huán),但目前尚缺乏防治和預(yù)測早產(chǎn)的有效手段,其主要原因是人類分娩啟動的機(jī)制尚未解析。因此,解析人類分娩啟動機(jī)制、優(yōu)生優(yōu)育已經(jīng)成為國際生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。糖皮質(zhì)激素是經(jīng)典的抗炎激素,可以誘導(dǎo)抗炎因子的合成并抑制炎癥介質(zhì)如前列腺素(PG)的合成,但大量實驗表明,糖皮質(zhì)激素對人羊膜前列腺素的合成具有反常的促進(jìn)作用,由于PG在分娩時可促進(jìn)子
2、宮平滑肌收縮即能誘發(fā)宮縮、促進(jìn)宮頸成熟及促進(jìn)胎膜破裂,所以其在分娩發(fā)動中起主導(dǎo)作用。因此糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜PG合成的作用可能是分娩發(fā)動的重要機(jī)制之一?,F(xiàn)已明確,糖皮質(zhì)激素的反常促進(jìn)羊膜前列腺素合成的作用是通過誘導(dǎo)羊膜成纖維細(xì)胞胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)和前列腺素H合酶-2(PGHS-2)即環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)來實現(xiàn)的,但其分子機(jī)制尚未闡明。本課題克隆了人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因的啟動子,在此基礎(chǔ)上研究了糖皮質(zhì)激素
3、反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因表達(dá)的分子機(jī)制,以初步解析糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞PG合成的分子機(jī)制。
研究內(nèi)容:
首先通過實時定量PCR從COX-2 mRNA水平驗證糖皮質(zhì)激素(GC)對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的反常促進(jìn)作用,同時研究糖皮質(zhì)激素對COX-2表達(dá)反常促進(jìn)作用的特點,即是否受糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)、其作用是否通過刺激轉(zhuǎn)錄過程實現(xiàn)的。其次,如果糖皮質(zhì)激素對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-
4、2表達(dá)確有反常促進(jìn)作用,而且此作用依賴于轉(zhuǎn)錄過程,我們則對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因啟動子進(jìn)行克隆及構(gòu)建報告基因重組質(zhì)粒并做進(jìn)一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗,以確定糖皮質(zhì)激素是否對COX-2基因啟動子具有直接作用以及糖皮質(zhì)激素對COX-2基因啟動子反常促進(jìn)作用的特點;如果糖皮質(zhì)激素確實對COX-2基因啟動子具有直接作用,那么我們需要進(jìn)一步確定COX-2基因啟動子上介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素作用的順式作用元件。為了驗證糖皮質(zhì)激素對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表
5、達(dá)的反常促進(jìn)作用的特異性,我們同時也在人胎兒肺成纖維細(xì)胞株(HFL-1)中做了比較對照實驗,以確認(rèn)糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的可靠性。
主要研究方法:
1、取樣、收集、培養(yǎng)人足月?lián)衿谄蕦m產(chǎn)羊膜成纖維細(xì)胞,抽提人羊膜成纖維細(xì)胞mRNA、逆轉(zhuǎn)錄并做熒光實時定量PCR檢測糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)對COX-2 mRNA水平的影響,并與HFL-1細(xì)胞進(jìn)行比較。
2、克隆人羊膜成纖維細(xì)胞C
6、OX-2基因啟動子,構(gòu)建COX-2基因啟動子熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞,研究在這兩種細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)對COX-2基因啟動子活性影響的異同。
3、構(gòu)建不同5'未端長度的COX-2啟動子報告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人羊膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞及HFL-1細(xì)胞以找出糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)對COX-2基因啟動子的大致調(diào)節(jié)位點,在此基礎(chǔ)上對可能位點進(jìn)行定點突變,以確認(rèn)介導(dǎo)皮質(zhì)醇作用的順式反應(yīng)元件。
7、 4.在上述實驗的基礎(chǔ)上,用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)的方法,研究所推斷的轉(zhuǎn)錄因子是否可以與所識別的介導(dǎo)皮質(zhì)醇作用的順式反應(yīng)元件相結(jié)合。
主要研究結(jié)果:
1.皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)確有反常促進(jìn)作用,而在人胎兒肺細(xì)胞株中糖皮質(zhì)激素對COX-2 mRNA的表達(dá)則是經(jīng)典的抑制作用,而且皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的反常促進(jìn)作用可以被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486和mRNA轉(zhuǎn)
8、錄抑制劑DRB所阻斷,說明此反常促進(jìn)是由GR受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)過程。
2.從培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞中成功克隆了COX-2基因啟動子-886bp~+33bp片段,經(jīng)測序,該序列與Genbank中所報道序列相同。將克隆的COX-2基因啟動子與含報告基因的質(zhì)粒進(jìn)行重組和擴(kuò)增,并用其轉(zhuǎn)染人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇在人羊膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞中對COX-2基因啟動子活性具有劑量依賴性促進(jìn)作用,而且可以被RU486所阻斷,
9、而在HFL細(xì)胞中皮質(zhì)醇對COX-2啟動子活性則是經(jīng)典的劑量依賴性抑制作用,而且也可以被RU486所阻斷,另外,皮質(zhì)醇還可以阻斷白細(xì)胞介素-1β對COX-2基因啟動子的誘導(dǎo)作用。
3.我們進(jìn)一步采用了由5'末端向3'末端逐漸刪除COX-2基因啟動子的方法,研究了介導(dǎo)皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞COX-2基因啟動子作用的反應(yīng)元件。研究發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的反常促進(jìn)作用的啟動子序列位于-66
10、bp下游,而介導(dǎo)皮質(zhì)醇對HFL-1細(xì)胞COX-2表達(dá)的經(jīng)典抑制作用的啟動子序列位于-453bp~-340bp之問。進(jìn)一步對上述片段所存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并對可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點堿基進(jìn)行定點突變,發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)皮質(zhì)醇反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因表達(dá)的順式反應(yīng)元件是位于-59bp~-53bp處的cAMP反應(yīng)元件(CRE),而介導(dǎo)皮質(zhì)醇對HFL-1細(xì)胞COX-2基因表達(dá)抑制作用的順式反應(yīng)元件是位于-448bp~-4
11、39bp處的NFκB結(jié)合位點。
4.ChIP研究發(fā)現(xiàn),在皮質(zhì)醇刺激人羊膜成纖維細(xì)胞后,CRE結(jié)合蛋白(CREB)與COX-2基因啟動子含CRE位點的DNA片段結(jié)合增加。表明CREB蛋白可能是參與人羊膜成纖維細(xì)胞中皮質(zhì)醇反常促進(jìn)COX-2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。
結(jié)論:皮質(zhì)醇通過COX-2基因啟動子的CRE反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2的表達(dá),而在HFL-1細(xì)胞皮質(zhì)醇通過COX-2基因啟動子的NFκB結(jié)合位點對CO
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