蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”對脂肪細胞和NAFLD大鼠模型肝臟組織糖脂代謝的影響及機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病率呈逐年上升趨勢，成為全球引起慢性肝病和肝功能異常的首要原因之一，在總體人群中患病率已高達15-30％。NAFLD 被認為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，主要病理生理機制為胰島素抵抗(IR)和氧化應激，病理表現(xiàn)為脂肪在肝臟積累。IR是以胰島素抑制肝臟釋放葡萄糖、促進周圍組織攝取和利用葡萄糖的能力下降為特征的病理生理過程。在NAFLD 狀態(tài)下，肝臟的糖脂代謝紊亂導致肝臟葡萄糖和VLDL的

2、輸出增加，血漿甘油三酯濃度升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL)水平降低。而脂肪組織的糖脂代謝紊亂則引起脂肪組織葡萄糖攝取減少和脂肪分解增加，產(chǎn)生過量的游離脂肪酸以及甘油進入血液循環(huán)。
　　 蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”即依據(jù)蒙醫(yī)對非酒精性脂肪肝(NAFLD)的病因病理機制的認識，以及“赫依”、“希拉”、“巴達干”等辯證論治理論，選出的對NAFLD 療效頗佳的利肝石榴八味散、地格達-4和通拉嘎-5 三味方劑。利肝石榴八味散是祛“巴達干”的代表

3、方劑；地格達-4是清“希拉”的代表方劑；通拉嘎-5是治療“赫依”的代表方劑。利肝石榴八味散的主要成分為石榴、肉桂、豆蔻、蓽茇、紅花、草果、干姜、光明鹽；地格達-4的主要成分為肋柱花、黃連、梔子、瞿麥；通拉嘎-5的主要成分為石榴、肉桂、豆蔻、蓽茇、紅花。蒙醫(yī)辯證治療糖尿病的臨床療效證明通拉嘎-5、利肝石榴八味散、地格達等藥物成分有輔助降糖作用，還可以改善血液粘度，治療早期糖尿病腎病，但其具體的作用機制不明。有文獻報道以地格達-4為主藥治療

4、NAFLD，可以使患者肝功能、B 超等指標恢復正常。臨床上有關于通拉嘎-5與辛伐他汀降脂效果的對比性研究，結(jié)果顯示通拉嘎-5 有明顯的降低總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇的作用，但至今沒有關于利肝石榴八味散對脂代謝影響的相關研究報道。但蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”
　　 治療NAFLD的具體機制尚不清楚，需要進一步的研究。
　　 本研究以3T3-L1脂肪細胞和NAFLD大鼠模型肝臟組織為研究對象，分別檢測利肝石榴八味散、地格

5、達-4、通拉嘎-5對它們的葡萄糖攝取和脂肪酸氧化的影響，并檢測在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用的PPARs、LXR α、I κ B α、iNOS、Akt、P-Akt的表達變化，以期明確蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”治療NAFLD的機制。
　　 方法：
　　 1、3T3-L1前脂肪細胞按照ATCC 推薦的方法培養(yǎng)，加入IBMX(終濃度0.5mM)、地塞米松(終濃度1μM)、胰島素(終濃度10mg/L)誘導分化為脂肪細胞。分化成熟的脂肪細胞用油

6、紅O 染色的方法進行鑒定。
　　 2、將分化成熟的脂肪細胞接種于96孔板，用蒙藥誘導細胞12小時、24小時、48小時、72小時，濃度分別為136.36mg/L、27.27mg/L、6.81mg/L、1.36mg/L、0.27mg/L，空白組和PBS組作為對照，吞噬MTT后檢測OD值，每組至少重復3孔。
　　 3、選用終濃度6.81mg/L、27.27mg/L的蒙藥處理細胞，PBS作為陰性對照共培養(yǎng)24h，[ 3 H]2-

7、DG 示蹤檢測脂肪細胞的葡萄糖攝取，14 C-palmitic 示蹤檢測脂肪細胞的脂肪酸氧化情況。
　　 4、選用終濃度6.81mg/L、27.27mg/L的蒙藥處理細胞48h，空白組和PBS組作為對照，Real-time PCR 檢測其PPARs和LXR α基因表達情況，western blot 檢測其PPARs、LXR α、I κ B α、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表達情況。
　　 5、Real-time PC

8、R 檢測NAFLD大鼠模型肝臟組織PPARs和LXR α基因表達情況，western blot 檢測其PPARs、LXR α、I κ B α、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表達情況。
　　 結(jié)論：κ B α蛋白表達明顯增加，LXR α和iNOS的蛋白表達顯著下降。通拉嘎-5 治療后，NAFLD大鼠肝臟組織PPAR α、γ、Akt、P-Akt、I κ B α蛋白表達明顯增加，LXR α和iNOS蛋白表達顯著下降，PPAR β蛋白

9、表達變化沒有統(tǒng)計學意義。
　　 1、3T3-L1前脂肪細胞被成功誘導分化為3T3-L1脂肪細胞，MTT 實驗顯示三種方劑對脂肪細胞的最佳作用時間均為48h，最佳作用濃度均為6.81mg/L。
　　 2、利肝石榴八味散可促進脂肪細胞的葡萄糖攝取，其機制可能與增加PPARs、I κ B α、Akt、P-Akt和抑制iNOS、LXR α表達有關。通拉嘎-5 也有促進脂肪細胞葡萄糖攝取的作用，其可能是通過上調(diào)PPAR α、PPA

10、R β、LXR α、I κ B α、Akt、P-Akt和下調(diào)iNOS表達實現(xiàn)的。不同的是，地格達-4 主要是促進脂肪細胞的脂肪酸氧化，其作用機制為增加PPAR α、PPAR β、I κ B α、Akt、P-Akt 而下調(diào)LXR α和iNOS蛋白表達。
　　 3、高脂飲食可以通過降低PPAR α、PPAR γ、I κ B α、Akt、P-Akt表達，增加LXR α、iNOS表達，來增加大鼠肝臟的脂肪積累，產(chǎn)生IR和氧化應激等，進一