基于構象表位印跡策略的腫瘤靶向納米載體研究.pdf

1、分子印跡技術是指在印跡材料的合成中構建與模板分子在大小、形狀和結構上都互補的特異性結合位點的技術。現(xiàn)分子印跡技術在小分子印跡技術方面已成熟并實現(xiàn)商品化，但在蛋白質分子印跡技術方面卻存在諸多挑戰(zhàn)。這是因為傳統(tǒng)的蛋白質分子印跡過程中具有蛋白質其理化性質及構效關系等因素、生產(chǎn)成本高等缺點，限制了其應用?，F(xiàn)行的靶向給藥系統(tǒng)的研究模式是通過膜蛋白的天然配體（如多肽、核酸適配體等）作為導向分子，并將其偶聯(lián)于載體表面以發(fā)揮導向功能，但天然配體存在體內(nèi)

2、外穩(wěn)定性差、免疫原性等問題，限制了靶向效率?；诖?，本課題將蛋白質分子印跡技術和靶向給藥系統(tǒng)相結合，提出一種構象表位印跡策略，設計與膜蛋白胞外區(qū)構象表位具有相似結構、核心序列一致的多肽，以該多肽為模板開展分子印跡，印跡形成的“空穴”對模板具有特異性結合，所制備的印跡聚合物納米粒能特異性靶向識別腫瘤表面特定的膜蛋白，且在生理條件下比較穩(wěn)定。
　　第一部分探索構象表位印跡策略的可行性。采用反相微乳液聚合法，以丙烯酰胺為功能單體、N，N

3、'-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑、蜂毒明肽(α螺旋結構，apamin)與其線性衍生物（其中四個半胱氨酸均被丙氨酸取代，linear apamin）為模板分子開展分子印跡，分別得到蜂毒明肽印跡聚合物納米粒(A-MIPNPs)與線性蜂毒明肽印跡聚合物納米粒(L-MIPNPs)，采用粒度儀測定其粒徑大小適宜，分散均勻;透射電鏡觀察顯示該納米粒的外觀形態(tài)圓整，與粒度儀測定結果一致。上述兩種表征結果均提示印跡聚合物納米粒成功構建。
　　印跡聚合

4、物納米粒對模板分子的結合能力實驗顯示與L-MIPNPs、非印跡聚合物納米粒(NIPNPs)相比，A-MIPNPs對模板apamin具有更好的選擇識別能力。納米粒中和蜂毒明肽及其膠束實驗顯示A-MIPNPs能將大部分蜂毒明肽及其膠束結合進入肝臟部位，而使蜂毒明肽及其膠束在脊髓部位的蓄積量減少;L-MIPNPs與NIPNPs則沒有與大部分蜂毒明肽及其膠束結合，蜂毒明肽及其膠束仍富集于脊髓部位。結果表明A-MIPNPs能中和小分子蜂毒明肽甚至

5、其大分子膠束。
　　上述研究顯示與線性蜂毒明肽印跡聚合物相比，蜂毒明肽印跡聚合物納米粒對模板apamin具有更強的結合能力，即以具有高級結構的多肽為模板的印跡聚合物比以具有線性結構的多肽為模板的印跡聚合物對模板分子的親和力更高，表明在一級序列相同時，印跡模板多肽的高級結構對印跡效果起關鍵作用。此外，我們初步掌握了構建印跡聚合物納米粒的方法及選擇了適宜的測定印跡納米粒與模板分子的相互作用的方法。
　　第二部分主要探索構建一種具

6、有腫瘤靶向性的印跡聚合物納米載體。首先，采用蛋白“嫁接”策略，以p32序列為模擬對象，以蜂毒明肽為模板，將p32上N端的關鍵氨基酸“嫁接”到蜂毒明肽上，經(jīng)圓二色譜表征，設計合成的多肽HAPPE具有典型的α螺旋結構。再以該多肽HAPPE為印跡模板分子，丙烯酰胺類為單體，采用反相微乳液聚合法開展分子印跡。印跡形成的納米粒的平均粒徑為40nm左右，大小適宜，分布均勻。體外結合實驗顯示印跡聚合物納米粒與p32結合平衡常數(shù)Kd為11.9-40.1

7、nM。選取N端具有α螺旋結構的磷脂酶A2、分子量與p32相近的小鼠神經(jīng)生長因子為競爭蛋白，但印跡納米粒與這兩種競爭蛋白均無結合，結果提示印跡聚合物納米粒具有與模板分子相同的“空穴”，并能與之進行特異性結合。流式細胞儀測定4T1和BxPC-3細胞對納米粒的攝取結果顯示MIPNPs組的熒光強度均是NIPNPs組的3倍左右;小動物活體成像測定體內(nèi)分布結果表明，與NIPNPs相比，MIPNPs能靶向識別腫瘤。細胞和體內(nèi)水平均表明印跡聚合物納米粒

8、對p32蛋白具有靶向性。對載體進行初步安全性評價，結果表明在一定的劑量范圍內(nèi)，印跡聚合物納米粒對細胞及機體均沒有明顯毒副作用，這為載體的應用奠定了基礎。
　　綜上所述，本課題提出了構象表位印跡策略并采用該策略構建了多肽功能分子“間接”介導腫瘤靶向的納米載體，有效規(guī)避了傳統(tǒng)的導向分子不穩(wěn)定性的問題，提高了印跡聚合物與模板分子的結合效果;證實了印跡模板多肽空間結構對印跡聚合物印跡效果的重要性，表明選擇靶蛋白的構象表位進行印跡所形成的印