基于細(xì)胞模型的線粒體DNA單倍型遺傳背景下長(zhǎng)壽機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：依據(jù)課題組前期研究結(jié)果，在中國人群中線粒體D4a單倍型是長(zhǎng)壽人群高頻單倍型，線粒體B4a和N9單倍型是長(zhǎng)壽人群低頻單倍型。為了探究線粒體基因組多態(tài)性與壽命調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制，我們篩選出D4a， B4a和N9單倍型個(gè)體，構(gòu)建細(xì)胞核背景相同線粒體DNA單倍型不同的單倍型融合細(xì)胞模型，對(duì)所構(gòu)建的融合細(xì)胞模型開展相關(guān)的線粒體功能實(shí)驗(yàn)，比較不同線粒體DNA單倍型融合細(xì)胞株的功能差異，以初步探究線粒體DNA單倍型遺傳背景下長(zhǎng)壽的相關(guān)機(jī)制。

2、　　方法：⑴選取來自同一地區(qū)、年齡為23-30歲健康青年人作為特定的單倍型篩選對(duì)象。提取被篩檢對(duì)象外周血DNA，經(jīng)特定的DNA序列擴(kuò)增和特異性限制性內(nèi)切酶作用，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定出三種單倍型個(gè)體。⑵抽取特定單倍型個(gè)體外周血，提取血小板與去除線粒體的143B骨肉瘤細(xì)胞融合，構(gòu)建單倍型融合細(xì)胞株。⑶提取融合細(xì)胞株包含mtDNA的總DNA，PCR擴(kuò)增線粒體DNA基因組，對(duì)不同線粒體單倍型融合細(xì)胞株的線粒體DNA全序列進(jìn)行分析。⑷對(duì)所構(gòu)建的

3、融合細(xì)胞模型開展相關(guān)的線粒體功能實(shí)驗(yàn)，比較不同線粒體DNA單倍型融合細(xì)胞株的功能差異：氧電極法檢測(cè)單倍型融合細(xì)胞株線粒體氧化磷酸化呼吸功能；ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)單倍型融合細(xì)胞株線粒體總的ATP產(chǎn)生量；熒光染料方法檢測(cè)單倍型融合細(xì)胞株線粒體膜電位水平；多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)單倍型融合細(xì)胞株ROS生成量。⑸使用熒光定量的方法檢測(cè)單倍型融合細(xì)胞株線粒體DNA拷貝數(shù)水平。⑹通過RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法檢測(cè)單倍型融合細(xì)胞株mtDNA編碼呼吸鏈復(fù)合體

4、亞基表達(dá)水平。⑺應(yīng)用非變性膠(BNG)的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)單倍型融合細(xì)胞株線粒體呼吸鏈復(fù)合體含量進(jìn)行檢測(cè)。⑻通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)不同種類的單倍型融合細(xì)胞株的功能進(jìn)行分析比較。
　　結(jié)果：①三組線粒體單倍型細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率、線粒體相關(guān)耗氧率的結(jié)果均為單倍型D4a細(xì)胞相對(duì)單倍型B4a和N9偏低，P值均小于0.05。②單倍型融合細(xì)胞株D4a相比較其他兩種融合細(xì)胞其線粒體ATP的總生成量顯著降低，P值分別小于0.05和0.01。③三種單倍型融合

5、細(xì)胞株線粒體膜電位水平并無差異。④細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)ROS生成量三種單倍型融合細(xì)胞無差異，線粒體特異性ROS生成量，單倍型融合細(xì)胞株D4a相對(duì)B4a單倍型融合細(xì)胞偏低，P值小于0.05。⑤三種單倍型融合細(xì)胞株線粒體DNA拷貝數(shù)并無差異。⑥線粒體DNA編碼的大部分呼吸鏈復(fù)合體亞基mRNA表達(dá)水平長(zhǎng)壽高頻單倍型D4a低于長(zhǎng)壽低頻單倍型N9，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001。⑦長(zhǎng)壽高頻單倍型D4a線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ含量明顯低于長(zhǎng)壽低頻

6、單倍型B4a和N9，P＜0.05， P＜0.01。
　　結(jié)論：⑴通過對(duì)所構(gòu)建的細(xì)胞模型進(jìn)行線粒體DNA全序列分析和線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)，確定所構(gòu)建的細(xì)胞和背景相同的單倍型融合細(xì)胞模型開展的線粒體功能檢測(cè)結(jié)果差異僅僅是由不同的線粒體DNA單倍型導(dǎo)致。⑵綜合細(xì)胞模型線粒體功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，單倍型融合細(xì)胞D4a的線粒體呼吸鏈活性相對(duì)B4a和N9較弱，推測(cè)可能相對(duì)較低的氧化磷酸化功能抑制了ATP的生成，同時(shí)也減少了有害物質(zhì)ROS的產(chǎn)生。⑶

7、線粒體復(fù)合體mtDNA編碼呼吸鏈復(fù)合體亞基mRNA水平及復(fù)合體蛋白表達(dá)水平不同，從而導(dǎo)致了不同單倍型之間線粒體功能的差異。⑷根據(jù)融合細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)長(zhǎng)壽高頻單倍型D4a相對(duì)長(zhǎng)壽低頻單倍型B4a和N9人群更傾向于抵抗衰老、壽命延長(zhǎng)的機(jī)制可能是:在特定的線粒體DNA單倍型遺傳背景下，該單倍型線粒體呼吸鏈復(fù)合體蛋白含量的相對(duì)偏低，含量相對(duì)較低的氧化磷酸化復(fù)合體系統(tǒng)使得其相應(yīng)的線粒體功能相對(duì)減弱，產(chǎn)生的ROS相對(duì)減少，氧化應(yīng)激作用相