綿羊MHCⅡDRA基因酵母表面展示庫(kù)的建立及其鑒定.pdf

1、目的：
　　比對(duì)分析得到綿羊基因組MHC區(qū)段DRA的基因序列及其exon2的序列；構(gòu)建釀酒酵母表面展示重組載體pYD1-DRA；對(duì)感染布魯氏菌及正常的綿羊個(gè)體的DRA基因exon2進(jìn)行DNA池化擴(kuò)增，同時(shí)分析其多態(tài)性，獲得多態(tài)位點(diǎn)；對(duì)OLA-DRA基因exon2兩端進(jìn)行快速定點(diǎn)基因突變，突變?yōu)樘囟盖形稽c(diǎn)；構(gòu)建DRA基因釀酒酵母表面展示庫(kù)；檢測(cè)OLA-DRA基因是否穩(wěn)定表達(dá)展示在釀酒酵母細(xì)胞表面，探索初步篩選與綿羊DRA蛋白相結(jié)合

2、的布魯氏菌抗原肽的可行途徑。為綿羊抗病選育以及進(jìn)一步研究MHC的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并提供一定的參考依據(jù)和理論支持，從而加快分子遺傳抗病育種的進(jìn)程。
　　方法：
　　1、將牛和綿羊MHCⅡDRA基因mRNA序列利用BLAST比對(duì)得到它們的基因序列和外顯子序列，繼而用GenBank中的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)查尋牛和綿羊的SNP位點(diǎn)。利用DNAMAN6.0軟件分析牛MHCⅡDRA外顯子的SNP位點(diǎn)，得到牛MHCⅡDRA有豐富多態(tài)性的外顯子序

3、列，通過(guò)DNAStar SeqMan軟件比對(duì)分析獲得與這些外顯子相似性較高的綿羊MHCⅡDRA基因exon2序列。
　　2、本試驗(yàn)利用布魯氏菌虎紅平板凝集診斷試劑盒和試管凝集試驗(yàn)對(duì)240只綿羊血液樣本進(jìn)行布魯氏菌陽(yáng)性血清檢測(cè)，然后利用PCR結(jié)合SSCP技術(shù)對(duì)MHCⅡDRA基因exon2的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，采用DNA池PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)600例布魯氏菌陽(yáng)性和陰性個(gè)體OLA-DRA基因exon2的SNPs再次進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)含有S

4、NP位點(diǎn)的exon2進(jìn)行克隆測(cè)序，運(yùn)用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析多態(tài)位點(diǎn)。
　　3、通過(guò)基因定點(diǎn)突變方法插入特定限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建OLA-DRA基因酵母表面展示庫(kù)，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，利用熒光顯微鏡檢測(cè)OLA-DRA蛋白是否展示在酵母細(xì)胞表面。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)生物信息學(xué)分析及基因克隆測(cè)序，得到與牛同源性高的綿羊MHCⅡDRA的基因序列，并于NCBI發(fā)布，GenBank登錄號(hào)為KR422362

5、，并分析比對(duì)得到其具有多態(tài)性的exon2的序列。
　　2、利用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)羊種布魯氏菌感染的陰陽(yáng)性，在240只綿羊中共檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陰性個(gè)體174只，陽(yáng)性個(gè)體66只，并對(duì)陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行復(fù)檢，最終布魯氏菌陽(yáng)性檢出率為27.5％。
　　3、利用PCR結(jié)合SSCP技術(shù)的方法對(duì)這240只綿羊MHCⅡDRA基因exon2進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)綿羊DRA基因exon2具有多態(tài)性，exon2序列第143bp發(fā)生了堿基突變，由

6、G變?yōu)锳，氨基酸由Arg變?yōu)镠is。
　　4、通過(guò)基因定點(diǎn)突變法成功插入特定限制性酶切位點(diǎn)，并成功構(gòu)建出OLA-DRA基因酵母表面展示庫(kù)，經(jīng)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，于熒光顯微鏡下顯現(xiàn)綠色熒光，DRA蛋白成功展示于酵母細(xì)胞表面。
　　結(jié)論：
　　1、通過(guò)PCR-SSCP方法對(duì)綿羊OLA-DRA基因的exon2進(jìn)行多態(tài)性分析，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)exon2具有多態(tài)性。
　　2、分析OLA-DRA基