澤瀉湯對血脂調(diào)節(jié)的膽固醇相關基因mRNA表達變化研究.pdf

1、目的：
　　 從中醫(yī)學的角度出發(fā)，高血脂癥的發(fā)病機制是本虛標實，本虛的臨床癥狀主要是脾胃氣虛和肝腎陰虛，標實的臨床癥狀表現(xiàn)為血瘀痰濁。高脂血癥的痰濁的產(chǎn)生與脾虛有著非常密切的聯(lián)系，其病機特點為中虛不運水液，水濕之邪上冒清陽，從而導致病人苦于頭目眩暈。所以二者同源異流，因而可以用來治療支飲的澤瀉湯也適用于治療高脂血癥，這實際上屬于“異病同治”，用該方治療高脂血癥符合中醫(yī)基礎理論?，F(xiàn)代藥理學和臨床研究表明澤瀉湯具有非常顯著的調(diào)節(jié)血脂

2、異常作用，對高脂血癥有很好的療效[2-8]。目前對澤瀉湯降脂方面的研究還比較少見，現(xiàn)有的已經(jīng)闡述的機理有：影響機體吸進外源性膽固醇，或者是干擾機體對內(nèi)源性膽固醇的分解代謝以及干擾機體的抗脂質過氧化作用[5-8]。這也體現(xiàn)了澤瀉湯對血脂代謝疾病的多途徑多靶點的整體治療作用效果。但是從分子生物學角度來研究澤瀉湯的調(diào)血脂作用機理，卻仍然處于摸索階段。在實驗中利用高脂飼料來造高血脂小鼠實驗模型，通過觀察肝臟組織病理形態(tài)學上的變化以及測定血清谷草

3、轉氨酶(AST)以及谷丙轉氨酶(ALT)含量多少從而研究高血脂小鼠肝功能損傷的程度；利用反轉錄聚合酶(RT-PCR)反應方法，測定肝組織中3-羥-3-甲基戊二酰酶A還原酶(HMG-CoA reductase)的表達情況，固醇反應元件結合蛋白因子-2(SREBF-2)，7α羥化酶(CYP7α1)一些與膽固醇代謝有關的基因在機體內(nèi)的表達情況以及活性，從而研究高血脂小鼠肝臟脂質物質代謝紊亂的分子作用機理。
　　 方法：
　　

4、選取雄性昆明小鼠，實驗前用普通飼料常規(guī)適應飼養(yǎng)1w小鼠；之后隨機分8只為第1組(空白對照組)繼續(xù)給予普通飼料，對其余40給予高脂飼料進行高脂造模，3w末尾靜脈取血分離血清，用半自動生化儀檢測血脂，若血脂水平升高則說明造模成功，隨機將造模成功的所有小鼠分為5組，每組均為8只。
　　 造模成功后各組以0.01ml·g-1的劑量對小鼠進行灌胃，每日1次連續(xù)4w。
　　 (1)空白對照組：給予普通飼料，灌胃時包含生理鹽水；

5、>　　 (2)模型對照組：給予普通飼料，灌胃時包含生理鹽水；
　　 (3)陽性對照組：給予高脂飼料同時以6.7mg·kg-1辛伐他汀灌胃；
　　 (4)澤瀉組：給予高脂飼料同時以2g·ml-1澤瀉單方溶液灌胃；
　　 (5)白術組：給予高脂飼料同時以2g·ml-1白術單方溶液灌胃；
　　 (6)復方組(澤瀉：白術=5:2)：喂養(yǎng)高脂飼料同時以2g·ml-1澤瀉湯復方溶液灌胃。
　　 各組小鼠均在

6、獨立的籠子中進行飼養(yǎng)，它們可以不受約束地飲水和攝食。實驗期間經(jīng)常觀察小鼠的狀態(tài)情況。需要灌胃的各組每日早上如上述所描述的進行。每周對各小組小鼠稱重一次，根據(jù)每只小鼠的體重來調(diào)整相應的劑量?？崭?，頸動脈采血，將獲得的血清用于如下一些指標的測定：血清總膽固醇(TC)濃度、甘油三酯(TG)濃度、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量、ALT和AST濃度。肝臟用于組織切片、RNA及脂質提取，并在實驗結束時測定臟器系數(shù)。
　　 2觀察肝臟組

7、織的形態(tài)和病理變化情況
　　 將摘取的肝組織首先進行照相，接著依次經(jīng)過甲醛的固定，石蠟的包埋，切片，然后HE染色后，通過光鏡來觀察肝組織病理學上變化的情況。
　　 3提取肝臟中的總脂類物質成分
　　 首先按照試劑盒說明書上所給出的步驟提取出肝臟總脂，然后測定肝臟中的膽固醇。
　　 4測定血清中的膽固醇相關指標、肝臟中的膽固醇
　　 通過RT-9600型全自動生化分析儀來測定血脂、血清ALT和血清A

8、ST這些指標。
　　 5測定肝臟組織中血脂相關的一系列基因mRNA的相對表達量
　　 用兩步法提取總RNA，以β-Actin作為內(nèi)參，用RT-PCR法測定HMG-CoA reductase，SREBF-2和CYP7α1 mRNAs的相對表達量。
　　 結果：
　　 1.澤瀉、白術和復方降低血清中膽固醇相關指標作用情況
　　 與模型組相比，澤瀉組和復方組中小鼠血清中TG和TC濃度都出現(xiàn)顯著性地降低，

9、同時血清HDL-C濃度顯著增加，澤瀉、白術和復方組小鼠血清ALT、AST活性增加，具有統(tǒng)計學意義；澤瀉、白術、復方均能不同程度降低小鼠肝臟、脾臟系數(shù)；灌胃4w后，與澤瀉組相比，復方能顯著降低小鼠體重，并且能顯著降低小鼠肝臟系數(shù)。
　　 2.澤瀉、白術和復方對肝組織中膽固醇相關一系列基因mRNA相對表達量的影響情況。
　　 當高血脂癥時，一系列與膽固醇代謝有關的基因表現(xiàn)出異常表達。其中，高血脂癥小鼠肝HMG-CoA red

10、uctase的激活伴隨著SREBF-2的激活。但是，高血脂癥小鼠肝中的7A羥化酶基因的表達沒有被激活。
　　 澤瀉和復方組都表現(xiàn)出膽固醇代謝有關的基因異常表達。在我們實驗條件下，澤瀉和復方均降低了血清TC的水平，同時相應的也激活了小鼠肝中HMG-CoA reductase表達。與澤瀉組相比，復方也激活了小鼠肝中SREBF-2的表達。但是，澤瀉和復方均小鼠肝中的CYP7α1基因的表達沒有被激活。
　　 白術對膽固醇代謝有關