布魯氏菌逃避溶酶體作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由感染人和動(dòng)物的布魯氏菌（Brucella）造成的對(duì)社會(huì)安全有嚴(yán)重危害的人畜共患病，特別是在經(jīng)濟(jì)較為落后的國(guó)家。布魯氏菌是一類兼性胞內(nèi)寄生菌，其能促進(jìn)自噬發(fā)生和逃避溶酶體的融合，獲得在宿主內(nèi)的復(fù)制和繁殖的能力。IV型分泌系統(tǒng)（Type IV secretion systems，T4SS）是布魯氏菌關(guān)鍵的毒力因子之一，其在機(jī)體與布魯氏菌相互作用中能分泌多種效應(yīng)蛋白。已有研究確定了11種布魯氏菌IV型分

2、泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，其中 TcpB、CstA和RicA的功能較清楚，但其他T4SS效應(yīng)蛋白的毒力表型及其調(diào)控機(jī)制還尚不清楚。本研究以布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白基因DK63-887、BMEI1135為研究對(duì)象，通過探討其對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌存活能力的影響及與布魯氏菌介導(dǎo)的自噬、逃避溶酶體融合的影響，為揭示細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為相關(guān)疫病的預(yù)防、控制工作奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：本研究以羊種布魯氏菌參考株16M為研究對(duì)

3、象，探討 T4SS效應(yīng)蛋白基因DK63-887、BMEI1135的功能及其在布魯氏菌致病過程中的作用機(jī)制。（1）構(gòu)建 DK63-887、BMEI1135基因的突變株，初步分析其生存能力。（2）探討IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因?qū)ρ蚍N布魯氏菌16M介導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響。（3）初步探究IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白 DK63-887、BMEI1135基因?qū)ρ蚍N布魯氏菌16M逃避溶酶體融合的影響。
　　方法：（1）以

4、16M為模板來分別擴(kuò)增 DK63-887、BMEI1135基因的上下游同源臂，以pUC19K質(zhì)粒為模板擴(kuò)增卡那霉素抗性基因；采用融合PCR和抗性替換技術(shù)，將以上片段融合，并連接載體pMD18-T Simple，構(gòu)建突變載體；之后將其電轉(zhuǎn)化至16M感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行PCR鑒定。將親本株16M、疫苗株M5-90、突變株16MΔDK63-887、16MΔBMEI1135在相同條件下震蕩培養(yǎng),觀察其生長(zhǎng)趨勢(shì)變化以及置于不同應(yīng)激環(huán)境中觀察其生存率

5、；將各菌株侵染以100:1的 MOI小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，在不同時(shí)間點(diǎn)分析其在胞內(nèi)的存活能力；用106CFU劑量腹腔注射接種BALB/c小鼠，分析其在體內(nèi)生存能力。（2）布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞RAW264.724 h后，利用投射電鏡觀察自噬泡的數(shù)量；利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)自噬ULK1、Beclin1基因mRNA和蛋白的表達(dá)；親本株和突變株侵染穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-LC3的小鼠巨噬細(xì)胞12 h，利用共聚焦

6、顯微鏡觀察自噬點(diǎn)形成情況。（3）構(gòu)建能夠表達(dá)綠色熒光的布魯氏菌，侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7，在24 h時(shí)用紅色探針分別對(duì)溶酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色，利用激光共聚焦觀察布魯氏菌分別與溶酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位情況。結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了 T4SS效應(yīng)蛋白 DK63-887、BMEI1135基因的突變株116MΔDK63-887、16MΔBMEI1135，在20代內(nèi)遺傳性穩(wěn)定；突變株和親本株的體外生長(zhǎng)趨勢(shì)相符合；體外刺激結(jié)果顯示

7、，突變株對(duì)酸、堿、高鹽、熱應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)缺陷和干燥的抵抗力降低；在感染小鼠巨噬細(xì)胞4、12、24和48 h時(shí)，突變株在胞內(nèi)存活能力和突變株免疫小鼠第4-10周，小鼠脾臟載菌量的均極顯著低于親本株16M組（P＜0.01）；（2）細(xì)胞自噬結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12 h時(shí)16MΔDK63-887、16MΔBMEI1135組的綠色熒光顆粒顯著降低（P＜0.01）；在24 h時(shí)突變株組細(xì)胞中Beclin1和ULK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平均顯著低于16M組

8、（P＜0.01）；與親本株16M相比較，突變株組中細(xì)胞包含自噬泡也明顯減少（P＜0.01）；（3）親本株和突變株侵染細(xì)胞24 h時(shí)突變株組胞內(nèi)的布氏小體與溶酶體共定位比例明顯升高（P＜0.01），而與高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位的比例較親本株16M均極顯著減少（P＜0.01）。
　　結(jié)論：（1）IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因缺失之后，可顯著降低16M在宿主體內(nèi)和體外的存活，從而可提高宿主的細(xì)胞免疫抵抗16M