Glut--1在喉癌Hep--2細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、化療抵抗中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是第二大呼吸道高發(fā)癌。LSCC一般按照腫瘤大小(Tumor size，T)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Cervical lymph node metastasis，N)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(Distantmetastasis，M)對(duì)其分期。原位癌的淋巴轉(zhuǎn)移直接影響其治療方式、患者生存期，研究報(bào)道，LSCC頸

2、部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別約為:T16-25％、T230-70％、T3及T465％-80％。一般LSCC預(yù)后不良的因素包括T、N分級(jí)升高及出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。然而，對(duì)于喉鱗狀細(xì)胞癌臨床預(yù)后影響因素的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道尚不一致。因此，本研究第一部分旨在研究不同臨床病理因素對(duì)LSCC預(yù)后的影響。
　　葡萄糖是腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移的主要能量來(lái)源，細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取主要依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucosetransporter，Glut)，其中Glu

3、t-1是細(xì)胞攝取葡萄糖的主要載體。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞自身更偏好于在厭氧環(huán)境中利用糖酵解途徑產(chǎn)生能量，為適應(yīng)腫瘤微環(huán)境，大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)Glut-1以滿足其能量的需要，因此，Glut-1作為惡性腫瘤基因治療的重要靶點(diǎn)成為近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Glut-1與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移有著密切的關(guān)系。大量研究報(bào)道，抑制腫瘤細(xì)胞Glut-1的表達(dá)能有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡。然而，Gult-1抑制對(duì)喉癌細(xì)

4、胞生長(zhǎng)及遷移的影響及其分子機(jī)制卻很少被報(bào)道。因此，本研究第二部分旨在探討Gult-1敲低對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響，并通過(guò)研究相關(guān)信號(hào)通路蛋白及基因的表達(dá)探討其分子機(jī)制。
　　自噬在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移中起著重要的作用，是一種真核細(xì)胞對(duì)損壞的蛋白或細(xì)胞器進(jìn)行降解并循環(huán)利用的過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移過(guò)程中扮演著促細(xì)胞存活與誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的雙重角色。一定程度的自噬促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲，而過(guò)度持續(xù)的自噬可激活腫瘤細(xì)胞自我降

5、解從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬相關(guān)蛋白Beclin1是細(xì)胞發(fā)生自噬的重要標(biāo)志物之一，在誘導(dǎo)自噬開始階段起著重要作用。研究證明調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞Glut-1基因及蛋白的表達(dá)可以通過(guò)影響細(xì)胞自噬通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移。然而，Gult-1對(duì)喉癌自噬的影響及其機(jī)制尚缺乏相關(guān)文獻(xiàn)支撐。因此，探索敲低Gult-1及調(diào)節(jié)Beclin1表達(dá)在喉癌Hep-2細(xì)胞自噬中的作用及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的回復(fù)效應(yīng)成為本研究的主要目的之一。
　　腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境在腫

6、瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療抵抗、復(fù)發(fā)中具有重要作用，尤其乏氧微環(huán)境和腫瘤治療抵抗、復(fù)發(fā)關(guān)系密切。實(shí)體瘤內(nèi)部乏氧微環(huán)境下誘導(dǎo)的新生血管形成、對(duì)葡萄糖的攝取和代謝增加是腫瘤對(duì)放、化療抵抗的重要原因。在乏氧的情況下HIF-1α表達(dá)急劇升高，激活Glut-1中mRNA過(guò)度表達(dá)及其產(chǎn)物的大量合成，以便轉(zhuǎn)運(yùn)更多的葡萄糖以滿足惡性腫瘤細(xì)胞高代謝率和快速生長(zhǎng)的需要，阻斷其中的某些重要環(huán)節(jié)對(duì)消除腫瘤治療抵抗與復(fù)發(fā)具有重要作用。而目前Glut-1與喉癌化療耐藥關(guān)

7、系的研究少見。因此，本研究第四部分旨在了解喉癌Hep-2細(xì)胞中Glut-1蛋白表達(dá)與腫瘤耐藥的關(guān)系，并通過(guò)RNA干擾阻斷喉癌Hep-2細(xì)胞Glut-1的表達(dá)，闡明Glut-1表達(dá)改變影響喉癌Hep-2細(xì)胞能量供應(yīng)及提高喉癌Hep-2細(xì)胞化療敏感性的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.回顧性研究2013年1月-2013年12月71例我院首次治療的喉鱗狀細(xì)胞癌患者，分析不同性別、年齡、TNM分期、臨床分期、腫瘤位置、病理分化程度、治

8、療方式等因素對(duì)患者預(yù)后的影響。
　　2.采用短發(fā)夾RNA（Short hairpin RNA，shRNA）抑制喉癌Hep-2細(xì)胞Glut-1蛋白及基因的表達(dá)，觀察對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，并研究其抑制細(xì)胞增殖及遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　3.通過(guò)雷帕霉素或高表達(dá)Beclin1從而促進(jìn)細(xì)胞自噬，研究Glut-1敲低+促進(jìn)自噬對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，通過(guò)敲低Beclin1從而抑制細(xì)胞自噬，研究Glut-1

9、敲低+抑制自噬對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響。以此探討Glut-1在喉癌細(xì)胞自噬中的作用及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的回復(fù)效應(yīng)。
　　4.篩選針對(duì)Hep-2細(xì)胞有效的Glut-1干擾片段siRNA以及對(duì)Hep-2細(xì)胞功能影響有效的順鉑濃度;通過(guò)RNA干擾抑制Glut-1表達(dá)對(duì)Hep-2細(xì)胞順鉑敏感性的影響，研究Glut-1表達(dá)改變影響Hep-2細(xì)胞化療敏感性的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.單因素生存分析顯示年齡、T分

10、期、鱗狀細(xì)胞癌的分化程度、治療方式對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生存率影響較小(P＞0.05)，聲門上型患者的死亡率顯著高于聲門型患者(P＜0.05)，提示聲門上型喉鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后較聲門型差;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其生存率顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌其預(yù)后較差(P＜0.01);臨床分期越高，患者死亡率越高，提示喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期越高預(yù)后越差（P=0.000）。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型回歸分析顯示，僅年齡、治療方式兩個(gè)變量對(duì)

11、患者預(yù)后的影響有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.Glut-1敲低顯著抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1(27％)及細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白c-myc(29％)的表達(dá)，從而抑制Hep-2的增殖活性（24h、48h、72h分別約為NC組的87.4％、73.2％、55.8％）;Glut-1敲低通過(guò)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白及基因的表達(dá)（約23.2％），促進(jìn)促凋亡相關(guān)的激活的Caspase3蛋白及基因的表達(dá)(2.45倍)，從而促進(jìn)H

12、ep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡（Glut-1 shRNA、Control、NC組細(xì)胞凋亡率分別約為25.9％、3.2％及3.1％）;Glut-1敲低通過(guò)上調(diào)抑制細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)（約2.1倍），下調(diào)促細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白N-cadherin蛋白及基因的表達(dá)（約降低45％），從而抑制喉癌細(xì)胞遷移（約降低57.6％）。
　　3.Gult-1敲低能促進(jìn)細(xì)胞自噬，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素及高表達(dá)Beclin1能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，自

13、噬誘導(dǎo)能進(jìn)一步促進(jìn)Gult-1敲低細(xì)胞的自噬水平;在Gult-1敲低的基礎(chǔ)上，過(guò)度誘導(dǎo)自噬會(huì)進(jìn)一步降低細(xì)胞增殖相關(guān)cyclinD1與c-myc蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步降低細(xì)胞存活率。在Gult-1敲低的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)自噬能進(jìn)一步下調(diào)Hep-2細(xì)胞抗凋亡相關(guān)Bcl-2，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在Gult-1敲低的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)自噬，能促進(jìn)抑制細(xì)胞遷移E-cadherin蛋白及基因的表達(dá)，而

14、抑制促細(xì)胞遷移N-cadherin蛋白及基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步抑制Hep-2細(xì)胞的遷移。反之，敲低Beclin1能顯著抑制細(xì)胞自噬，能有效逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低引起的細(xì)胞自噬水平的升高，能逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低引起的細(xì)胞增殖活性降低，上調(diào)細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，自噬抑制能有效逆轉(zhuǎn)Gult-1敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力降低的效應(yīng)。
　　4.在4組RNA干擾抑制Hep-2細(xì)胞Gult-1表達(dá)組中

15、，siRNA726組的抑制效果最佳，并同時(shí)對(duì)MRP1基因產(chǎn)生抑制;在3種不同順鉑濃度對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞功能影響中，3μg/mL的順鉑濃度對(duì)Hep-2細(xì)胞抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用效果最好;Hep-2細(xì)胞RNA干擾抑制Glut-1表達(dá)后可以抑制MRP1基因及蛋白的表達(dá)，順鉑可以上調(diào)Hep-2細(xì)胞RNA干擾抑制Glut-1表達(dá)后MRP1基因及蛋白的表達(dá)，且RNA干擾抑制Glut-1對(duì)MRP1基因及蛋白的抑制作用大于順鉑的促進(jìn)作用。
　　

16、結(jié)論：
　　1.年齡、N分期、臨床分期、腫瘤位置、治療方式等因素可能對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后有一定影響。
　　2.Gult-1的敲低能抑制Hep-2細(xì)胞的增殖;促進(jìn)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡;抑制Hep-2細(xì)胞遷移。
　　3.shRNAGlut-1及誘導(dǎo)自噬可以影響喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移;shRNA Glut-1可以通過(guò)影響自噬調(diào)節(jié)喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移。
　　4.RNA干擾抑制Glut-1后可以抑制MR