1,25-二羥基維生素D3對(duì)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠Th1、Th17活化的影響.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病(inflammatorybowel disease，IBD)的一種，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，一般認(rèn)為是由包括感染在內(nèi)的環(huán)境因素作用于易感傾向個(gè)體，誘發(fā)異常免疫反應(yīng)所致。大量研究表明，免疫因素是其最基本的發(fā)病機(jī)制。
　　CD4+T細(xì)胞的T輔助(T helper，Th)1/Th17細(xì)胞具有促炎癥生成的特點(diǎn)，在UC腸道免疫反應(yīng)過(guò)程中的作用越來(lái)越得到重視。在各種抗原的

2、刺激下，Th1/Th17細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子被激活，介導(dǎo)其發(fā)生免疫應(yīng)答，繼而分泌相關(guān)的細(xì)胞因子，如干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白介素-17(interleukin-17，IL-17)等，這些細(xì)胞因子具有強(qiáng)大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答、清除細(xì)胞內(nèi)的病原體和誘導(dǎo)T細(xì)胞活化等功能，進(jìn)

3、而誘導(dǎo)并促進(jìn)炎癥的發(fā)生，最終啟動(dòng)UC的發(fā)病。
　　1，25-二羥基維生素D3(1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25(OH)2D3)是維生素D(Vitamin D，VitD)的活性代謝產(chǎn)物，屬于開環(huán)甾類化合物激素。1，25(OH)2D3除了調(diào)節(jié)鈣和骨的代謝外，因免疫細(xì)胞中存在其受體(vitamine D receptor，VDR)，故具有其相關(guān)的生物活性。維生素D通過(guò)與單個(gè)核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及致敏淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)

4、胞表面的VDR結(jié)合調(diào)節(jié)Th細(xì)胞，尤其是Th1/Th17細(xì)胞的功能，進(jìn)而抑制自身免疫性疾病的發(fā)展。VitD產(chǎn)生和/或作用不足參與粘膜損傷的發(fā)生，使消化道感染的風(fēng)險(xiǎn)增高，增加UC發(fā)病的危險(xiǎn)。大量研究表明，VitD缺乏與UC的發(fā)病有關(guān)，補(bǔ)充VitD可以降低UC的發(fā)病率。
　　目的：探討VitD對(duì)右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用及其作用機(jī)制，以期為臨床UC的維持治療提

5、供一種新的有效藥物。
　　方法：①30只雄性C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分入Control組、DSS組和DSS+VD組，每組10只。Control組一直飲用蒸餾水；DSS組和DSS+VD組間斷飲用2％DSS，時(shí)間段為分別為第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天、第27和第28天，其余時(shí)間飲用蒸餾水。造模第14天起開始治療：DSS+VD組給予1，25(OH)2D3(0.2μg/25g/天)灌胃，治療14天；C

6、ontrol組與DSS組給予等體積PBS灌胃14天作為對(duì)照，第29天處死小鼠。②每天觀察小鼠精神狀態(tài)、體重變化、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食以及大便性狀，并評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)。③觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，并計(jì)算結(jié)腸的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)評(píng)分。④檢測(cè)結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的含量。⑤檢測(cè)各組小鼠血清鈣的水平。⑥提取腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric

7、 lymphnodes，MLN)中的單個(gè)核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，應(yīng)用ELISA檢測(cè)其上清液中的IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平。⑦應(yīng)用HE染色觀察結(jié)腸組織的病理學(xué)改變。⑦應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot技術(shù)和real-time Q-PCR技術(shù)分別檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ蛋白及mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①在慢性結(jié)腸炎小鼠模型中，與Control組相比較，DSS組小鼠體重明

8、顯下降(15.5％±1.50％vs0.0％±0.0％，P<0.05)，而DSS+VD組小鼠體重較DSS組顯著回升(5.2％±0.53％vs19.6％±1.82％，P<0.05)；與Control組相比，DSS組動(dòng)物DAI評(píng)分顯著增加(3.77±0.36 vs0.00±0.00，P<0.05)，經(jīng)過(guò)治療后，DSS+VD組DAI評(píng)分顯著降低(1.79±0.19 vs3.77±0.36，P<0.05)。②與Control組相比，DSS組小鼠結(jié)

9、腸長(zhǎng)度顯著縮短(4.35cm±0.48 cm vs5.98 cm±0.44 cm，P<0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯，形態(tài)學(xué)評(píng)分升高(2.50±0.58 vs0.00±0.00，P<0.05)，結(jié)腸病理學(xué)觀察顯示黏膜上皮缺損，淺潰瘍生成，腺體破壞或消失，可見黏膜層、黏膜下層甚至肌層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理評(píng)分顯著增加(9.80±1.26 vs0.00±0.00，P<0.05)；而經(jīng)過(guò)治療后，DSS+VD組結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增加(3.78 c

10、m±0.89 cm vs4.35cm±0.48 cm，P<0.01)，病理評(píng)分較DSS組顯著降低(7.00±0.82 vs9.80±1.26，P<0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯減輕(1.50±0.58 vs2.50±0.58，P<0.05)，結(jié)腸組織病理切片結(jié)果提示黏膜上皮相對(duì)完整，無(wú)潰瘍生成，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。③與Control組相比，DSS組結(jié)腸MPO活性升高(1.30 U/g±0.09U/g vs0.18 U/g±0.01

11、U/g，P<0.05)，而經(jīng)過(guò)治療后，DSS+VD組MPO活性顯著降低(0.41 U/g±0.03 U/g vs1.30 U/g±0.09 U/g，P<0.05)。④血鈣檢測(cè)結(jié)果顯示，Control組、DSS組和DSS+VD組血鈣的濃度分別為2.50±0.03mmol/L，2.33±0.06 mmol/L，3.33±0.32 mmol/L，各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。⑤DSS組MLN中的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)顯著多于Control組(

12、6.56×106±0.06×106/mL vs1.63×106±0.27×106/mL，P<0.01)，經(jīng)過(guò)治療后，DSS+VD組細(xì)胞數(shù)顯著下降(3.51×106/mL±0.18×106/mL vs6.56×106±0.06×106/mL，P<0.01)。ELISA檢測(cè)MLN單個(gè)核細(xì)胞上清液中IL-17、TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平顯示：Control組MLN單個(gè)核細(xì)胞未經(jīng)刺激前IL-17、TNF-α、IFN-γ和IL-6的分

13、泌水平為(IL-17:0.22ng/mL±0.04 ng/mL，TNF-α：0.046 ng/mL±0.004 ng/mL，IFN-γ：0.02ng/mL±0.01 ng/mL，IL-6:0.012 ng/mL±0.01 ng/mL)，經(jīng)CD3/CD28刺激后上述因子的水平都顯著增高(IL-17:1.85 ng/mL±0.14 ng/mL，TNF-α：0.068ng/mL±0.006 ng/mL，IFN-γ：1.43 ng/mL±0.1

14、5 ng/mL，IL-6:0.15 ng/mL±0.01ng/mL，P<0.01)，與Control組相比，DSS組小鼠MLN單個(gè)核細(xì)胞刺激前IL-17、TNF-α、IFN-γ和IL-6分泌水平(IL-17:0.58 ng/mL±0.10 ng/mL，TNF-α：0.17 ng/mL±0.02 ng/mL，IFN-γ：0.61 ng/mL±0.12 ng/mL，IL-6:0.14ng/mL±0.01 ng/mL，P<0.01)與CD3/

15、CD28刺激后的分泌水平(IL-17:12.23ng/mL±1.03 ng/mL，TNF-±：0.35 ng/mL+0.04 ng/mL，IFN-γ：6.67 ng/mL±0.46 ng/mL，IL-6:0.47 ng/mL±0.06 ng/mL，P<0.01)均顯著高于Control組，給予1，25(OH)2D3治療后，未刺激的DSS+VD組小鼠MLN單個(gè)核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平較DSS組明顯降低(IL-17:0.38 ng/mL±0

16、.04 ng/mL vs0.58 ng/mL±0.10 ng/mL，TNF-α：0.13 ng/mL±0.01 ng/mL vs0.17 ng/mL+0.02 ng/mL，IFN-γ：0.41 ng/mL±0.13 ng/mL vs0.61 ng/mL±0.12 ng/mL，IL-6：0.07 ng/mL±0.01 ng/mL vs0.14 ng/mL±0.01 ng/mL，P<0.01)，同樣CD3/CD28刺激后IL-17、TNF-

17、α、IFN-γ和IL-6的分泌水平較DSS組也明顯降低(IL-17:6.35 ng/mL±0.34 ng/mL vs12.23 ng/mL±1.03 ng/mL，TNF-α：0.24 ng/mL±0.02 ng/mL vs0.35 ng/mL±0.04 ng/mL，IFN-γ：4.45ng/mL±0.41 ng/mL vs6.67 ng/mL±0.46 ng/mL，IL-6:0.43 ng/mL±0.04ng/mL vs0.47 ng/

18、mL±0.06 ng/mL，P<0.01)。⑥免疫組織化學(xué)染色可見：在Control組，炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-6僅有少量表達(dá)，DSS組小鼠結(jié)腸組織中上述4中蛋白表達(dá)水平較Control組顯著增加(IL-17：0.70±0.10 vs0.17±0.05，P<0.05；TNF-α：0.85±0.10 vs0.25±0.05，P<0.05；IL-6:0.65±0.07 vs0.10±0.01，P<0.05；IFN-

19、γ：0.90±0.10 vs0.20±0.05，P<0.05)，經(jīng)過(guò)治療后，DSS+VD組的表達(dá)水平較DSS組顯著下降(IL-17：0.40±0.08 vs0.70±0.10，P<0.05；TNF-α：0.35±0.08 vs0.85±0.10，P<0.05；IL-6:0.30±0.02 vs0.65±0.07，P<0.05；IFN-γ：0.45±0.07 vs0.90±0.10，P<0.05)。⑦Western blot和real-t

20、ime Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，DSS組結(jié)腸組織中IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ蛋白(IL-17:1.81±0.10vs1.21±0.05；TNF-α：1.79±0.10 vs1.04±0.05，P<0.05；IL-6:1.75±0.13 vs1.00±0.05，P<0.05；IFN-γ：2.06±0.10 vs1.32±0.05，P<0.05)及mRNA的表達(dá)水平顯著升高(IL-17 mRNA：1

21、.91±0.86 vs1.00±0.00，P<0.05；TNF-α mRNA：1.94±0.64 vs1.00±0.00，P<0.05；IL-6 mRNA：2.04±0.02 vs1.00±0.00，P<0.05；IFN-γ mRNA：2.11±0.11 vs1.00±0.00，P<0.05)。經(jīng)過(guò)治療之后，IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ蛋白(IL-17:1.48±0.08 vs1.81±0.10，P<0.05；TNF-α

22、：1.44±0.08 vs1.79±0.10，P<0.05；IL-6:1.34±0.11 vs1.75±0.13，P<0.05；IFN-γ：1.73±0.07 vs2.06±0.10，P<0.05)及mRNA的表達(dá)均顯著下降(IL-17 mRNA：1.56±0.30 vs1.91±0.86，P<0.05；TNF-α mRNA：1.39±0.67vs1.94±0.64，P<0.05；IL-6 mRNA：1.33±0.01 vs2.04±0