谷氨酰胺對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及TNF--α和NF--κB p65表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究谷氨酰胺(Glutamine，Gln)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、遷移能力以及TNF-α和NF-κB p65表達(dá)的影響，探討谷氨酰胺對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549的增殖抑制作用及其可能機(jī)制。
　　方法：(1)人肺腺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)：以含10％胎牛血清（不含谷氨酰胺）的DMEM培養(yǎng)基，置于飽和濕度、CO2濃度為5％、溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞傳代3～4次后，用于后續(xù)

2、實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分7組：空白對(duì)照組（無(wú)藥物干預(yù)）;按谷氨酰胺濃度梯度分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組：2mmol/L;4mmol/L;8mmol/L;16mmol/L;32mmol/L;64mmol/L。各組按谷氨酰胺干預(yù)時(shí)間分為：24h組;48h組;72h組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集每組細(xì)胞，利用CCK-8法檢測(cè)各組的吸光度值（OD值），并計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，比較各組之間的差異;篩選出適宜抑制濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌A549細(xì)胞接種于Tra

3、nswell小室，再給予篩選出的適宜谷氨酰胺濃度干預(yù)48小時(shí)，于5％CO2、37℃恒溫孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后染色并于顯微鏡下觀察和拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估A549細(xì)胞遷移能力。(4)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌A549細(xì)胞接種于96孔板，按篩選出的谷氨酰胺濃度干預(yù)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集各組細(xì)胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定各組細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)水平，比較各組之間TNF-α表達(dá)的差異。(5)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人

4、肺腺癌A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，按篩選出的谷氨酰胺濃度干預(yù)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白免疫印跡雜交法(Western Blot)測(cè)定各組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的表達(dá)，比較各組之間NF-κB p65表達(dá)的差異。
　　結(jié)果：(1)CCK-8結(jié)果顯示：Gln對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用與干預(yù)濃度有關(guān)。低濃度Gln(2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L)干預(yù)組對(duì)A549細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用;與對(duì)照組相比，

5、高濃度Gln(16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)干預(yù)組對(duì)A549細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制作用增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);同一時(shí)間點(diǎn)32mmol/L組和64mmol/L組對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用無(wú)明顯差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Gln(32mmol/L)干預(yù)組的遷移細(xì)胞數(shù)量

6、明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(3)ELISA結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，不同濃度(16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)的Gln干預(yù)人肺腺癌A549細(xì)胞株后，對(duì)A549細(xì)胞中TNF-α表達(dá)均有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但32mmol/L組和64mmol/L組之間TNF-α的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(4)Western Blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，不同濃度

7、(16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)的Gln干預(yù)人肺腺癌A549細(xì)胞株后，對(duì)A549細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)均有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但32mmol/L組和64mmol/L組之間NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：(1)谷氨酰胺可以抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，32mmol/L可能為最適抑制濃度。(2)谷氨酰胺可以抑制人肺腺癌A549細(xì)