沉默HO-1增強低濃度5-氮雜胞苷誘導SKM-1細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、目的：探討慢病毒介導小干擾RNA沉默HO-1增強低濃度5-氮雜胞苷誘導SKM-1細胞凋亡的作用及其機制。
　　方法：Real-time PCR檢測MDS/AML細胞株在5-氮雜胞苷加藥前后以及MDS患者（n=48）骨髓血單個核細胞HO-1基因表達；經(jīng)慢病毒介導小干擾RNA轉(zhuǎn)染SKM-1細胞以沉默HO-1基因表達，并分組為空白組、空載體組、沉默HO-1組，三組細胞分別予以5-氮雜胞苷、Hemin聯(lián)合5-氮雜胞苷處理；MTT法檢測調(diào)控

2、 HO-1表達后，低濃度5-氮雜胞苷對SKM-1細胞生長抑制的影響；流式細胞術(shù)檢測調(diào)控 HO-1表達后，低濃度5-氮雜胞苷對SKM-1細胞凋亡及周期的影響；Real-time PCR檢測調(diào)控HO-1表達后， DNMT1、p16及p16下游相關(guān)周期基因（CDK4、CDK6、CyclinD1、p21、p27、p57、RB及E2F1）表達；Western blot進一步分析p16下游相關(guān)周期蛋白（CDK4、CDK6、CyclinD1、pRB、

3、E2F1及p27）及凋亡蛋白（Caspase-3、Cleaved caspase-3、BCL-2及Bax）表達；甲基化特異性PCR分析調(diào)控HO-1表達后，p16基因啟動子的甲基化程度的改變；建立空白組、空載體組、沉默HO-1組SKM-1細胞 NOD/SCID小鼠血液腫瘤模型，并分別予以生理鹽水或5-氮雜胞苷治療，記錄其體重變化及生存時間，瑞氏染色檢測荷瘤小鼠外周血SKM-1細胞，流式細胞術(shù)檢測荷瘤小鼠外周血人 CD45+ SKM-1細胞

4、比例。
　　結(jié)果：SKM-1細胞在經(jīng)5-氮雜胞苷作用后，HO-1基因表達增加（P<0.05），且高危組與極高危組MDS患者骨髓血單個核細胞HO-1表達較低危組增高（P<0.05）；MTT結(jié)果顯示，5-氮雜胞苷以濃度依賴性方式抑制SKM-1細胞生長，而沉默HO-1后，SKM-1細胞的生長抑制率較空白組和空載體組均增加（P<0.05），而經(jīng)Hemin上調(diào)HO-1表達則明顯減弱5-氮雜胞苷誘導的SKM-1細胞生長抑制效應；流式細胞術(shù)結(jié)果

5、顯示，沉默 HO-1表達后，5-氮雜胞苷誘導的 SKM-1細胞凋亡率由空載體組：28.08％±0.04增加到48.64%±0.09（P<0.05），而經(jīng)Hemin聯(lián)合5-氮雜胞苷處理后，空載體組、沉默HO-1組凋亡率則分別下降為15.95%±0.04、31.43%±0.07， 且沉默HO-1促進5-氮雜胞苷誘導的SKM-1細胞凋亡依賴于Caspase-3凋亡途徑；沉默HO-1表達后，5-氮雜胞苷誘導的SKM-1細胞G0/G1期

6、阻滯由空載體組：30.03%±0.05增加到59.39%±0.11（P<0.05），而經(jīng)Hemin聯(lián)合5-氮雜胞苷處理后，空載體組、沉默 HO-1組 SKM-1細胞 G0/G1期比例均分別下降為21.58%±0.03、39.29%±0.04；Real-time PCR結(jié)果顯示，在5-氮雜胞苷加藥的情況下，與空載體組相比，沉默HO-1組SKM-1細胞DNMT1表達明顯減弱， p16表達顯著增加，p16下游周期相關(guān)基因CDK4、CDK6、R

7、B、E2F1表達減低， p27表達增加（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示，在5-氮雜胞苷加藥的情況下，與空載體組相比，沉默 HO-1組SKM-1細胞p16表達增加，p16下游周期蛋白CDK4、CDK6、pRB、E2F1表達減低，p27表達增加（P<0.05），同時，凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax表達增加及BCL-2表達減低（P<0.05）；甲基化特異性PCR結(jié)果顯示，沉默HO-1顯著增加5-氮雜胞苷誘

8、導的p16基因啟動子去甲基化水平（P<0.05），而經(jīng)Hemin上調(diào)HO-1表達則可以減弱AZA誘導的p16基因啟動子去甲基化作用；體內(nèi)研究表明，與5-氮雜胞苷治療的空載體組荷瘤小鼠相比，經(jīng)5-氮雜胞苷治療的沉默HO-1組荷瘤小鼠體重減輕程度降低，生存時間延長，小鼠外周血 SKM-1細胞數(shù)量明顯減少，小鼠外周血人 CD45+SKM-1細胞比例顯著減低（P<0.05）。
　　結(jié)論：沉默HO-1增強5-氮雜胞苷對SKM-1細胞的生長抑