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文檔簡介
1、目的:我們的研究采用低劑量的去甲基化藥物5-氮雜胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)對KYSE450食管癌細胞株進行表觀治療,隨后檢測DNA甲基化轉移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)的表達與KYSE450食管癌細胞株生長狀態(tài)改變情況。探討低劑量的去甲基化藥物5-Aza對KYSE450食管癌細胞株是否有效,以及DNMTs的表達與KYSE450食管癌細胞株生長狀態(tài)之間的關系。
方法:1.采用5
2、-Aza不同的藥物濃度處理KYSE450食管癌細胞株,使用蛋白印記雜交技術(Westernblotting)檢測細胞中γH2AX蛋白表達,選取不產(chǎn)生細胞毒性的相對最大藥物劑量用于后續(xù)實驗的用藥濃度。2.應用甲基化特異性PCR(MethylationSpecificPolymeraseChainReaction,MSP)檢測用藥前及用藥后不同時間點DNMT1基因和DNMT3b基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)改變情況。3.應用Westernblot
3、檢測用藥前及用藥后不同時間點DNMT1基因和DNMT3b基因蛋白表達改變。4.應用實時熒光定量PCR(QuantitativeRealtimePolymeraseChainReaction,qRT-PCR)技術檢測用藥前及用藥后不同時間點DNMT1基因和DNMT3b基因mRNA的表達改變。5.應用流式細胞儀分析各組細胞的細胞周期變化。
結果:1.應用5-Aza處理KYSE450食管癌細胞72h后,測得1000nM/L的藥物濃度
4、為不產(chǎn)生藥物毒性的相對最大劑量。2.KYSE450食管癌細胞在低劑量的5-Aza治療后,DNMT1、DNMT3b基因甲基化降低,隨時間的延長呈現(xiàn)先遞減后遞增的趨勢。3.去甲基化作用能夠增加DNMT1、DNMT3b基因的表達沉默,使該基因mRNA和蛋白表達減少,均出現(xiàn)先遞減后遞增的一致趨勢,并且能導致細胞周期阻滯,抑制細胞的增殖。
結論:1.低劑量的5-Aza對細胞不產(chǎn)生毒副作用,且能逆轉DNMT1、DNMT3b甲基化狀態(tài),為臨
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