放線菌素D對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150放療后WISP-1表達(dá)量的研究.pdf

1、背景和目的:
　　食管癌是全球最常見的十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球癌癥發(fā)病率的第8位，死亡率居全球癌癥死亡率的第6位。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，放療漸漸成為治療食管癌的主要方法。但是目前影響食管癌放療療效的因素很多，如腫瘤乏氧狀態(tài)、腫瘤谷胱甘肽含量、腫瘤本身放射敏感性及放射抗拒等，其中，放射抗拒對(duì)食管癌的放療療效有很大影響[1]。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，WISP-1與食管癌密切相關(guān)。WISP—1與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)多種組織

2、惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。而放線菌素D作為一種細(xì)胞周期非特異性藥物，能抑制RNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)WISP-1的表達(dá)量有嚴(yán)重影響。
　　縱觀這些臨床試驗(yàn)，食管癌的放療抗拒仍是影響食管癌放療的重要因素，目前沒有很好的解決方法。而WISP-1與食管癌的發(fā)生有密切影響。由此，本實(shí)驗(yàn)通過放線菌素D對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150放療后WISP-1表達(dá)量的研究，目的是探究WISP-1表達(dá)量與食管癌細(xì)胞株KYSE-150的關(guān)系，并探討放線菌素

3、D對(duì)WISP-1表達(dá)量的影響。
　　方法:
　　1.對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE-150細(xì)胞進(jìn)行傳代、培養(yǎng)、復(fù)蘇。
　　2.把KYSE-150細(xì)胞復(fù)蘇，分裝到2個(gè)培養(yǎng)皿中，編號(hào)分別為1、2。1號(hào)培養(yǎng)皿加入10ul的溶解在DMSO的5 ug/ml的放線菌素D，2號(hào)培養(yǎng)皿加入20ul的溶解在DMSO的10 ug/ml的放線菌素D，采用MTT法測(cè)細(xì)胞數(shù)。
　　3.取出2個(gè)沒接受照光的培養(yǎng)皿（1個(gè)培養(yǎng)皿加入了放線菌素D，另一個(gè)

4、沒加放線菌素D），采用采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)WISP-1基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)NF-KB等基因進(jìn)行檢測(cè)。
　　4.把食管癌細(xì)胞株KYSE-150復(fù)蘇，分裝到32個(gè)培養(yǎng)皿中，分別加入10ml的1640培養(yǎng)液。其中8個(gè)培養(yǎng)皿加入20ul的溶解在DMSO的10 ug/ml的放線菌素D，余下24個(gè)培養(yǎng)皿加入20ul DMSO。拿出28個(gè)培養(yǎng)皿（其中7個(gè)培養(yǎng)皿有放線菌素D，21個(gè)培養(yǎng)皿沒加放線菌素D）到機(jī)房予6GY照光。<

5、br>　　5.取8個(gè)沒加放線菌素D的培養(yǎng)皿（7個(gè)培養(yǎng)皿取出時(shí)間分別為照光后15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，1個(gè)培養(yǎng)皿沒照光，取出時(shí)間為24小時(shí)），分別對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿提取RNA、反轉(zhuǎn)錄，采用RT-PCR測(cè)WISP-1表達(dá)量的變化，以GAPDH做內(nèi)參。
　　6.取8個(gè)沒加放線菌素D的培養(yǎng)皿（7個(gè)培養(yǎng)皿取出時(shí)間分別為照光后15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，1個(gè)培養(yǎng)皿沒接受照光，

6、取出時(shí)間為24小時(shí)），分別對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿提蛋白、測(cè)蛋白濃度，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)測(cè)WISP-1表達(dá)量的變化，以GAPDH做內(nèi)參。
　　7.取8個(gè)加放線菌素D的培養(yǎng)皿（7個(gè)培養(yǎng)皿取出時(shí)間分別為照光后15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，1個(gè)培養(yǎng)皿沒接受照光，取出時(shí)間為24小時(shí)），分別對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿提蛋白、測(cè)蛋白濃度，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)測(cè)WISP-1表達(dá)量的變化，以GAPDH做內(nèi)參。

7、r>　　8.取8個(gè)沒加放線菌素D的培養(yǎng)皿（7個(gè)培養(yǎng)皿取出時(shí)間分別為照光后15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，1個(gè)培養(yǎng)皿沒接受照光，取出時(shí)間為24小時(shí)），分別對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿提取上清，采用ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)WISP-1表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.10ug/ml放線菌素D既能抑制RNA的轉(zhuǎn)錄，又對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)是沒有明顯毒性。
　　2.2個(gè)沒接受照光的培養(yǎng)皿采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反(RT-PCR)檢測(cè)WI

8、SP-1基因發(fā)現(xiàn)加有放線菌素D的培養(yǎng)皿WISP-1明顯降低，同時(shí)NF-KB等其他基因的表達(dá)也受抑制。
　　3.8個(gè)沒加放線菌素D的培養(yǎng)皿采用RT-PCR發(fā)現(xiàn)照光3小時(shí)后WISP-1表達(dá)量開始升高。
　　4.8個(gè)沒加放線菌素D的培養(yǎng)皿采用Western Blot發(fā)現(xiàn)照光3小時(shí)后WISP-1表達(dá)量開始升高。
　　5.8個(gè)加放線菌素D的培養(yǎng)皿采用Western Blot發(fā)現(xiàn)照光3小時(shí)后WISP-1表達(dá)量無明顯變化。