5-脫氧雜氮胞苷對(duì)小鼠附植前胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、小鼠附植前胚胎發(fā)育過(guò)程中，DNA甲基化一直處于動(dòng)態(tài)變化中。受精后首先雄原核在DNA復(fù)制前發(fā)生快速的主動(dòng)去甲基化，第一次卵裂后，由于缺少維持DNA甲基化的酶-Dnmtl，合子基因組發(fā)生被動(dòng)去甲基化直到桑椹胚，囊胚時(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)重新建立甲基化，而滋養(yǎng)層細(xì)胞仍然維持低甲基化狀態(tài).5-脫氧雜氮胞苷(5-AZA-CdR)是常用的去甲基化試劑，在研究胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤治療等方面有重要作用.本試驗(yàn)即利用5-AZA-CdR去甲基化的性能研究DNA甲基

2、化與小鼠附植前胚胎發(fā)育的關(guān)系.通過(guò)本試驗(yàn)的研究不僅可以深入理解小鼠胚胎發(fā)育與DNA甲基化的關(guān)系，而且對(duì)于探討5-AZA-CdR的作用機(jī)理、為其更好的應(yīng)用于腫瘤治療也有所幫助。 1. 5-AZA-CdR與小鼠附植前胚胎發(fā)育 將不同濃度的5-AZA-CdR(0.2，1.0和5.0 μM)分別從原核期胚胎、2-細(xì)胞期胚胎和4-細(xì)胞期胚胎加入，持續(xù)作用直至體外發(fā)育完畢，結(jié)果表明，從原核期加入時(shí)，0.2和1.0μM能支持胚胎發(fā)育到

3、4-細(xì)胞，5.0 μM只能支持胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞：從2-細(xì)胞期加入時(shí)，0.2和1.0 μM能支持部分胚胎發(fā)育到8-細(xì)胞，但8-細(xì)胞不能致密化，5.0μM只能支持胚胎發(fā)育到4-細(xì)胞；從4-細(xì)胞期加入時(shí)，0.2和1.0 μM雖然能支持胚胎發(fā)育到早期桑椹胚，但卻沒有一個(gè)能夠繼續(xù)發(fā)育到囊胚，而5.0 μM處理中，也有部分發(fā)育到桑椹胚，但比例顯著低于對(duì)照組(p<0.05).綜合以上結(jié)果，表明5-AZA-CdR降低了小鼠附植前胚胎的發(fā)育能力，尤其對(duì)

4、8-細(xì)胞期以后的影響更大，并且這種影響是濃度依賴性的。 從TUNEL和Annexin-V的檢測(cè)結(jié)果看，5.0 μM 5-AZA-CdR處理得到的8-細(xì)胞和桑椹胚發(fā)生凋亡，而低濃度的5-AZA-CdR則沒有引起胚胎的凋亡，說(shuō)明5-AZA-CdR引起的小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯一定程度上與它引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)。 2. 5-AZA-CdR與小鼠附植前胚胎的DNA甲基化 采用免疫熒光的方法檢測(cè)基因組DNA甲基化水平，并用Ima

5、ge軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的相對(duì)定量。從5-MeC免疫熒光的結(jié)果來(lái)看，5-AZA-CdR處理后，8-細(xì)胞和早期桑椹胚(致密化8-細(xì)胞)的DNA甲基化水平顯著降低(p<0.05)；但2-細(xì)胞和4-細(xì)胞胚胎中DNA甲基化水平同對(duì)照組相比并沒有明顯改變(p>0.05)。 因?yàn)?-AZA-CdR引起的DNA甲基化變化是通過(guò)Dnmtl誘導(dǎo)的，所以對(duì)各時(shí)期胚胎中Dnmtlo的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)，5-AZA-CdR處理前后Dnmtlo在2-細(xì)胞

6、和4-細(xì)胞胚胎中都只在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；而在8-細(xì)胞和早期桑椹胚時(shí)，5-AZA-CdR處理后，Dnmtlo從細(xì)胞核中消失.說(shuō)明8-細(xì)胞和早期桑椹胚DNA甲基化的降低與Dnmtlo由細(xì)胞核中消失有一定的關(guān)系.維持DNA正常甲基化對(duì)于小鼠附植前胚胎后期(8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚)的發(fā)育非常重要，而且正常DNA甲基化的維持必須有Dnmtlo的參與。 3. 5-AZA-CdR與發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá) 本試驗(yàn)從分子水平上探討DNA甲基化與小鼠

7、附植前胚胎發(fā)育的關(guān)系.首先采用BrUTP免疫熒光的方法從基因組整體水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)2-細(xì)胞和4-細(xì)胞胚胎的轉(zhuǎn)錄活性同對(duì)照相比沒有顯著差異(p>0.05)，而8-細(xì)胞和早期桑椹胚的轉(zhuǎn)錄活性顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。 進(jìn)一步選取與胚胎致密化和氣穴化關(guān)系密切的基因Cx31、Cx43、Cx45、Cdh1和Ctnnbl，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定它們的mRNA表達(dá)量的變化.結(jié)果表明，5-AZA-CdR處理前后，2-細(xì)胞和4-