骨髓間充質干細胞移植對視神經損傷家貓視網膜神經節(jié)細胞及腦源性神經營養(yǎng)因子表達影響的研究.pdf

1、人類的中樞神經系統(tǒng)受損傷后不能再生軸突，視神經損傷后視網膜神經節(jié)細胞亦是如此，易導致視網膜神經節(jié)細胞凋亡，這種不可逆的視網膜神經節(jié)細胞損傷，是致盲的主要原因。促進軸突的再生，預防視神經損傷后神經元的死亡，從而恢復有效視功能是外傷性視神經病的主要治療目的。近年來，隨著外傷性視神經病機理的深入研究及相關實驗研究工作的不斷開展，外傷性視神經病的治療途徑亦有多種，如周圍神經移植；神經營養(yǎng)因子的注射治療；以及雪旺細胞、嗅鞘細胞、干細胞移植等已經在

2、很多的實驗研究中進行了報道。然而，現在由于資源的限制，組織移植免疫排斥反應以及視網膜神經節(jié)細胞臨時保護系統(tǒng)等諸多原因，目前有效治療神經修復和防止視網膜神經節(jié)細胞凋亡的方法還很有限。
　　近年來，骨髓間充質干細胞移植在治療中樞神經系統(tǒng)疾病或外傷性視神經病方面顯示出巨大的潛力和優(yōu)勢。據報道在脊髓損傷后的動物模型中骨髓間充質干細胞能持續(xù)分泌神經營養(yǎng)因子，這被認為是一個軸突再生的影響機制。此外，神經營養(yǎng)因子剝奪及缺乏已被證明是視網膜神經節(jié)

3、細胞凋亡的主要原因。以前的研究已經表明神經營養(yǎng)因子，包括腦源性神經營養(yǎng)因子、神經生長因子、神經膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子等等，具有營養(yǎng)成熟神經元的作用，并且能夠參與損傷神經的再生及其功能的恢復。作為神經營養(yǎng)因子家族的一員，腦源性神經營養(yǎng)因子對視網膜神經節(jié)細胞再生具有深刻的影響，并且有利于神經元之間的突觸連接。視神經損傷后骨髓間充質干細胞移植促進神經保護及延遲視網膜神經節(jié)細胞凋亡的作用如何呢？是否是通過分泌腦源性神經營養(yǎng)因

4、子來實現仍然是未知的。
　　本研究旨在探討玻璃體腔內注射移植體外培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞能否增加視神經損傷后家貓的視網膜神經節(jié)細胞存活數量，及其可能的潛在增長機制，希望通過研究為視神經受損傷后的有效修復治療提供新的思路和方法。本課題主要分為以下三個部分分別進行基礎研究和觀察。
　　第一部分 貓骨髓間充質干細胞的體外分離培養(yǎng)、純化、鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)、純化家貓的骨髓間充質干細胞，并對獲得細胞的表面標志物進行鑒定，為

5、進一步利用骨髓間充質干細胞移植治療視神經損傷家貓的的研究奠定基礎。
　　方法：利用全骨髓貼壁法對家貓骨髓間充質干細胞進行體外分離、培養(yǎng)、純化；通過間斷更換培養(yǎng)液獲得較純化的骨髓間充質干細胞，倒置相差顯微鏡下對細胞形態(tài)進行觀察；根據第1、3、5、7、9代細胞的鏡下增殖情況繪制出生長曲線；通過流式細胞儀檢測細胞表面標志抗原CD34、CD44和CD90的表達率。
　　結果：在倒置相差顯微鏡下觀察，分離培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞貼壁呈梭

6、形或紡錘形；原代細胞生長叢集成片，5～7d達到融合，進行傳代；培養(yǎng)到第三代以后，細胞出現相對均勻的梭形扁平外觀，迅速增殖的細胞呈渦流樣排列；第3、5代骨髓間充質干細胞增殖能力強于第7、9代；采用流式細胞儀分析鑒定表明，細胞的CD34、CD44和CD90陽性率分別為17.5％、97.9%和91%，這與骨髓間充質干細胞表面抗原的表達一致。
　　結論：分離培養(yǎng)的細胞具有骨髓間充質干細胞特性，培養(yǎng)所得細胞就是骨髓間充質干細胞，其成分相對單

7、一。第3、5代細胞純度高，增殖能力強，適合用于進一步的實驗研究。
　　第二部分 標準化家貓外傷性視神經損傷動物模型的建立
　　目的：利用統(tǒng)一標準的視神經夾在相同鉗夾時間下對家貓視神經進行損傷實驗，觀察視神經部分損傷后家貓的閃光視覺誘發(fā)電位的變化，建立標準化的外傷性視神經損傷家貓動物模型。
　　方法：共有10只健康的成年家貓，每只家貓的右眼為實驗眼(視神經損傷)，左眼為對照眼（正常）。家貓的右眼損傷眼均以統(tǒng)一標準的視神經

8、夾鉗夾視神經30秒，制成家貓視神經部分損傷模型。在實驗眼損傷后1小時、3天、1周、2周、4周時分別進行實驗眼和對照眼的閃光視覺誘發(fā)電位檢查，記錄主波Pl00的峰潛時和波幅，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：所有家貓正常對照眼的閃光視覺誘發(fā)電位的波形穩(wěn)定，隨時間延長均無明顯變化。損傷前實驗組與對照組主波Pl00的峰潛時、波幅兩組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；實驗組傷后各時間段主波Pl00的峰潛時延長及波幅降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計

9、學意義(P＜0.05)。
　　結論：應用統(tǒng)一標準的視神經夾可以成功建立標準化的外傷性視神經損傷家貓動物模型。閃光視覺誘發(fā)電位檢查是確定標準化家貓外傷性視神經損傷動物模型建立成功與否的客觀評價指標，成功的視神經損傷家貓動物模型表現為閃光視覺誘發(fā)電位主波Pl00的峰潛時延長及波幅降低。
　　第三部分 骨髓間充質干細胞移植對視神經損傷家貓視網膜神經節(jié)細胞及腦源性神經營養(yǎng)因子表達的影響
　　目的：本研究旨在探討玻璃體腔內注射移

10、植體外培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞能否增加視神經損傷后家貓的視網膜神經節(jié)細胞存活數量，以及其可能的潛在作用機制。
　　方法：在外傷性視神經損傷家貓動物模型成功建立后，骨髓間充質干細胞移植組予玻璃體腔內注射骨髓間充質干細胞，磷酸鹽緩沖液組予玻璃體腔內注射磷酸鹽緩沖液。分別在移植后的3天、7天、14天及28天，用免疫熒光染色雙十八烷基四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽染色標記法觀察分離視網膜的視網膜神經節(jié)細胞存活率，用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試

11、驗方法檢測分離視網膜的腦源性神經營養(yǎng)因子的含量。
　　結果：分析表明，在術后3天、7天、14天及28天，在周邊區(qū)及中央區(qū)視網膜上視網膜神經節(jié)細胞密度均顯著減少（周邊區(qū)：P3d=0.0446,P7d=0.0011,P14d＜0.001,P28d＜0.001；中央區(qū)：P3d=0.0437,P7d=0.0067,P14d＜0.001,P28d＜0.001）。7天、14天、28天后骨髓間充質干細胞移植組視網膜神經節(jié)細胞密度顯著高于磷酸鹽緩