穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因遺傳減毒原蟲(chóng)治療疾病的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人類許多疾病是由某種蛋白質(zhì)表達(dá)低于正常水平或者某種蛋白質(zhì)突變導(dǎo)致蛋白失活所引起的，針對(duì)這類疾病，目前的治療策略主要是通過(guò)補(bǔ)充適量相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽達(dá)到緩解疾病癥狀[1][2]。比如人工合成胰島素治療糖尿病[3]，能夠快速的緩解糖尿病癥狀及促進(jìn)糖尿病導(dǎo)致的并發(fā)癥快速的恢復(fù)。
　　相比傳統(tǒng)化學(xué)藥物，生物制劑（蛋白及多肽類）具有針對(duì)性強(qiáng)、活性高、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在目前的人類疾病治療中發(fā)揮了越來(lái)越重要作用。然而，目前應(yīng)用的臨床治療的蛋白質(zhì)

2、及多肽類的生物制劑仍然較少，探究其主要原因有以下幾點(diǎn):①該類藥物屬于蛋白質(zhì)或多肽類分子，運(yùn)輸和儲(chǔ)存都需要低溫、低濕等嚴(yán)苛條件，一旦環(huán)境發(fā)生改變很容易導(dǎo)致藥物失活;②大部分蛋白質(zhì)及多肽在人體內(nèi)代謝速度快，半衰期短（一般是幾分鐘左右）[4]，無(wú)法到達(dá)有效的血藥濃度。雖然目前通過(guò)改變其氨基酸序列、加側(cè)鏈、加用緩釋劑[5]等方法來(lái)延長(zhǎng)其半衰期，但是仍然存在許多問(wèn)題:改變其序列結(jié)構(gòu)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且極有可能導(dǎo)致其活性的降低甚至消失，也無(wú)法達(dá)到延

3、長(zhǎng)其半衰期的目的。半衰期問(wèn)題的限制了很多蛋白質(zhì)及多肽應(yīng)用于臨床治療疾病。所以我們現(xiàn)在亟需要解決生物藥半衰期短的問(wèn)題。③絕大部分生物制劑還只能通過(guò)靜脈或者皮下注射，半衰期短導(dǎo)致了患者經(jīng)常需要多次注射該類藥物，造成了依從性的下降。而這些問(wèn)題都直接限制了該類藥物在臨床疾病治療中的使用。尋找一種能夠克服這些缺點(diǎn)的手段一直以來(lái)都是蛋白多肽類生物制劑研究的熱點(diǎn)。
　　人體寄生蟲(chóng)是與人類協(xié)同進(jìn)化而來(lái)的，為了適應(yīng)了人體內(nèi)的環(huán)境，寄生蟲(chóng)已經(jīng)發(fā)展了多

4、種免疫逃避和抑制機(jī)制，從而得以在宿主體內(nèi)存活，而且有些寄生蟲(chóng)還可能處于長(zhǎng)期感染狀態(tài)。隨著基因修飾技術(shù)的迅速發(fā)展，目前已經(jīng)可以對(duì)單細(xì)胞的寄生原蟲(chóng)進(jìn)行成功的基因修飾，通過(guò)敲除某些原蟲(chóng)發(fā)育階段的關(guān)鍵基因使其減毒，減緩其在人體內(nèi)的生長(zhǎng)速度，甚至可以達(dá)到條件性控制原蟲(chóng)在體內(nèi)的增殖。另外，原蟲(chóng)在宿主體內(nèi)寄生的過(guò)程中，會(huì)主動(dòng)分泌多種蛋白抗原及多肽類物質(zhì)進(jìn)入宿主血液中[6]。相對(duì)于原核的細(xì)菌，原蟲(chóng)作為真核生物能夠正確的翻譯、折疊人源性蛋白質(zhì)及多肽;這些

5、都提示我們?cè)x(chóng)具備與宿主長(zhǎng)期共存、能夠準(zhǔn)確表達(dá)人源蛋白及毒性小等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造能夠使其成為宿主內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)生物制劑的工具，從而克服現(xiàn)有生物制劑運(yùn)輸困難、半衰期短及多次給藥等缺點(diǎn)，有望成為一種新的生物治療手段。
　　本研究擬嘗試?yán)迷x(chóng)中研究較多的瘧原蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)為載體，通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鼠源瘦素(Leptin)蛋白的減毒約氏瘧原蟲(chóng)，驗(yàn)證其能否表達(dá)鼠源Leptin蛋白，并探討其感染小鼠后，對(duì)小鼠

6、體重的影響;同時(shí)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人黑色素瘤抗原gp100蛋白的尿嘧啶缺陷型RH株弓形蟲(chóng)，為今后探討其能否誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生gp100抗原特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
　　一、感染瘦素蛋白轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲(chóng)顯著降低小鼠體重
　　1.成功構(gòu)建含Leptin基因的瘧原蟲(chóng):通過(guò)在pYC框架質(zhì)粒(for plasmid for P.yoeliiCRISPR/Cas9)中插入sgRNA序列，以及裝入帶Leptin基因的同源臂，然后將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)

7、入瘧原蟲(chóng)體內(nèi)，通過(guò)乙胺嘧啶抗性篩選出帶有pYC重組質(zhì)粒的陽(yáng)性瘧原蟲(chóng)，再通過(guò)限制性稀釋法成功篩選出轉(zhuǎn)基因成功的單克隆的瘧原蟲(chóng)。
　　2.轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)能表達(dá)Leptin:通過(guò)提取瘧原蟲(chóng)的cDNA，然后通過(guò)擴(kuò)增得到MIF-Leptin基因，送上海英俊公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示MIF與Leptin基因融合轉(zhuǎn)錄;然后用mouse Leptin抗體對(duì)瘧原蟲(chóng)進(jìn)行間接免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)能表達(dá)瘦素蛋白。
　　3.感染轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)顯

8、著降低小鼠體重:分別通過(guò)腹腔注射轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)、野生型瘧原蟲(chóng)感染C57小鼠，對(duì)照組注射等量PBS溶液，隨后隔天檢測(cè)其原蟲(chóng)血癥及體重并記錄;最后統(tǒng)計(jì)學(xué)分析原蟲(chóng)血癥與體重的關(guān)系，結(jié)果顯示原蟲(chóng)血癥在一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)能夠降低C57/BL6小鼠體重，而野生型瘧原蟲(chóng)不能。
　　二、成功構(gòu)建表達(dá)黑色素瘤抗原gp100的轉(zhuǎn)基因減毒弓形蟲(chóng)
　　1.成功構(gòu)建弓形蟲(chóng)CRISPR-Cas9質(zhì)粒和同源臂質(zhì)粒:通過(guò)高保真酶對(duì)框架質(zhì)粒(pSAG1-

9、Cas9-U6-sgUPRT)進(jìn)行擴(kuò)增，然后環(huán)化，將sgRNA序列裝入框架質(zhì)粒中;通過(guò)重疊PCR的方法構(gòu)建同源臂并插入重組質(zhì)粒中。
　　2.成功篩選和克隆表達(dá)gp100的轉(zhuǎn)基因減毒弓形蟲(chóng):將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)入弓形蟲(chóng)體內(nèi)，然后通過(guò)乙胺嘧啶抗性篩選出電轉(zhuǎn)成功的弓形蟲(chóng)。
　　本研究主要嘗試以人體寄生蟲(chóng)中的瘧原蟲(chóng)弱毒株和減毒弓形蟲(chóng)作為載體表達(dá)和分泌宿主蛋白質(zhì)。通過(guò)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將小鼠瘦素基因插入瘧原蟲(chóng)基因