基于質(zhì)譜技術(shù)的阿爾茲海默癥小鼠腦組織中標(biāo)志物的定量技術(shù)研究.pdf

1、阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease，AD)是影響全球數(shù)百萬(wàn)人并與年齡有關(guān)的神經(jīng)性疾病。其主要的病理標(biāo)志特征是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的沉積和tau蛋白的過(guò)磷酸化，分別形成細(xì)胞外斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)。這個(gè)過(guò)程的許多機(jī)制細(xì)節(jié)仍然是未知的，但蛋白質(zhì)聚集的一個(gè)確定結(jié)果是阿爾茨海默癥腦中的突觸功能障礙和神經(jīng)元損失，包括線(xiàn)粒體功能障礙，氧化應(yīng)激，炎癥和金屬代謝在內(nèi)的不同途徑都被認(rèn)為與這一過(guò)程有關(guān)。金屬離子如

2、銅，鋅和鐵在健康和疾病狀態(tài)的大腦中均發(fā)揮重要作用，并且金屬離子在體內(nèi)含量和分布的變化是不同神經(jīng)退行性疾病和衰老的共同特征。阿爾茨海默癥標(biāo)志性蛋白和其中的金屬結(jié)合性質(zhì)可能是病理生理過(guò)程中重要的生物化學(xué)基礎(chǔ)。
　　本文建立了一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的對(duì)腦組織中Aβ蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量的方法。測(cè)量生物樣品中低豐度的Aβ1-40是阿爾茨海默癥研究中一個(gè)有意義的指標(biāo)。以13C標(biāo)記的Aβ1-40蛋白為內(nèi)標(biāo)，利用Aβ1-40蛋白三種抗體M3.2、4G

3、8、11A50B的共同作用進(jìn)行免疫沉淀，酸性（pH=2）70℃加熱條件下洗脫，并與基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)聯(lián)用，Aβ1-40蛋白標(biāo)準(zhǔn)品回收率可達(dá)到48.7％。利用該方法和ELISA試劑盒法分別測(cè)定小鼠腦組織勻漿上清中Aβ1-40的含量，兩者沒(méi)有顯著性差異(p＞0.1)，該方法特異性好，并且操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性、準(zhǔn)確度好，更適用于市面上沒(méi)有對(duì)應(yīng)ELISA試劑盒的蛋白。
　　本文還建立了ID-ICP-MS方

4、法，測(cè)定小鼠腦組織的皮層、海馬、丘腦及其他腦區(qū)中的鐵、銅、鋅三種元素含量，并對(duì)檢測(cè)限、定量限、精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照鼠，模型組鼠腦中鐵、銅、鋅在不同腦區(qū)中的含量有明顯差異。銅、鋅元素主要沉積在小鼠海馬、皮層腦區(qū)，而鐵元素主要沉積在小鼠海馬區(qū)域。利用ELISA方法測(cè)定模型組與對(duì)照組小鼠不同腦區(qū)中的蛋白含量，以探究與阿爾茲海默癥有關(guān)的蛋白和金屬間的關(guān)系。結(jié)果表明，Aβ1-40蛋白、Aβ1-42蛋白、淀粉樣

5、前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）、tau蛋白均是海馬、皮層中的含量較高，且模型組含量高于對(duì)照組，這與鐵、銅、鋅在各腦區(qū)中的分布很類(lèi)似。而金屬硫蛋白-3（Metallothionein-3，MT-3）在模型組小鼠各腦區(qū)中含量均低于對(duì)照組，且各腦區(qū)中含量差異不大。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，對(duì)所得的各蛋白和金屬間的關(guān)系進(jìn)行了機(jī)理方面的解釋。
　　本文新建立了兩種方法分別定量小鼠腦組織中的蛋白和小鼠各腦區(qū)中的金屬