抗心肌Na+-Ca2+交換體α-1(138-177)和α-2(840-877)多克隆抗體的制備及其功能研究.pdf

1、目的：在制備抗心肌Na/Ca交換體α-1（138-177）和α-2（840-877）兩種多克隆抗體的基礎(chǔ)上，分別觀察它們對大鼠心肌細胞Na+/Ca2+交換體、L型鈣通道、瞬時外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道電流的影響。
　　 方法：
　　 1.抗體制備和純化：用化學(xué)合成的Na+/Ca2+交換體α-1（138-177）和α-2（840-877）短肽對新西蘭大耳白兔進行主動免疫獲取抗血清，間接ELISA法檢測免疫后抗血清效價，用P

2、roteinA層析柱對抗體進行親和純化。
　　 2.膜片鉗全細胞記錄：應(yīng)用膜片鉗全細胞記錄模式觀察抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1（138-177）和α-2（840-877）兩種多克隆抗體分別對心肌細胞Na+/Ca2+交換電流、L型鈣電流、瞬時外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流的影響。
　　 3.采用EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms軟件對Na+/Ca2+交換體α-l(138-177)、α

3、-2(840-877)短肽序列分別與L型鈣通道孔環(huán)的氨基酸序列進行了比對。
　　 結(jié)果：
　　 1.抗體效價、濃度及純化結(jié)果：間接ELISA法檢測結(jié)果表明，在第三次加強免疫后，抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1（138-177）和α-2（840-877）抗血清效價均高達1：243000。抗血清經(jīng)ProteinA純化后發(fā)現(xiàn)，抗α-1（138-177）和α-2（840-877）抗體濃度分別為13.1mg/ml和7.21mg/

4、ml。SDS-PAGE檢測顯示，純化后的兩種抗體在電泳時分別出現(xiàn)清晰的2條帶，其分子量分別為25和50kD左右。
　　 2.抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1（138-177）和α-2（840-877）兩種多克隆抗體對成年大鼠心肌細胞Na+/Ca2+交換電流及其他離子通道電流的影響：膜片鉗全細胞記錄結(jié)果表明，在1-104nmol/L濃度范圍內(nèi)，抗α-1（138-177）和抗α-2（840-877）兩種多克隆抗體對大鼠心肌細胞外向

5、和內(nèi)向Na+/Ca2+交換電流均表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。對兩種多克隆抗體作用選擇性的研究發(fā)現(xiàn)，102-104nmol/L的抗α-1抗體，104nmol/L的抗α-2抗體對L型鈣電流也具有抑制作用。兩種抗體在1-104nmol/L濃度范圍內(nèi)對瞬時外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流均無明顯作用。
　　 3.Na+/Ca2+交換體α-l(138-177)、α-2(840-877)短肽序列分別與L型鈣通道氨基酸序列的相似性比較：氨基酸序列比

6、對表明，Na+/Ca2+交換體α-l(138-177)重復(fù)序列與L型鈣通道第4結(jié)構(gòu)域孔環(huán)（1442-1483位氨基酸）序列的相似度為27.7％；Na+/Ca2+交換α-2(840-877)短肽序列與L型鈣通道第2結(jié)構(gòu)域孔環(huán)（697-730位氨基酸）序列的相似度為23.7％。
　　 結(jié)論：
　　 1．本研究采用主動免疫和親和純化的方法，制備并獲得了高濃度和高純度的抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1（138-177）和α-2

7、（840-877）兩種多克隆抗體，為對其進行進一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2．在低濃度（抗α-1抗體濃度≤10nmol/L，抗α-2抗體濃度≤103nmol/L）條件下，抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1（138-177）和α-2（840-877）抗體均可特異性地抑制大鼠心肌Na+/Ca2+交換體。
　　 3．在高濃度（102-104 nmol/L的抗α-1抗體，抗α-2抗體濃度104nmol/L）時，抗心肌Na+