缺血性腦卒中CNS表達MHCⅠ類分子的靶向成像及TLR4特異性阻斷治療的實驗研究.pdf

1、既往研究認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)是免疫豁免區(qū)，正常生理情況下的成年動物CNS不表達MHCⅠ類分子或表達量極低，近年來研究表明CNS感染及損傷刺激能夠誘導(dǎo)MHCⅠ類分子的表達，且該分子與腦組織的二次損傷和修復(fù)過程密切相關(guān)。研究已經(jīng)證實小鼠缺血性腦卒中7天后MHCⅠ類分子表達增強。作為世界范圍內(nèi)致死致殘率最高的疾病之一，提高對腦卒中的診斷與治療水平，降低腦卒中的致殘率和死亡率是當(dāng)務(wù)之急。缺血

2、半暗帶的存在是急性缺血性腦卒中血管再通以及血管神經(jīng)保護治療的理論基礎(chǔ)和關(guān)鍵靶點。而缺血性腦卒中急性期MHCⅠ類分子的時空特異性表達情況，以及MHCⅠ類分子是否能夠用作腦缺血成像分子靶標(biāo)的研究未見報道。這兩項研究不僅對進一步了解該分子參與缺血缺氧性腦損傷及修復(fù)的機制有重要意義，也對缺血性腦卒中的靶向性成像具有重要應(yīng)用價值。
　　本研究首先在小鼠腦缺血性卒中模型及體外神經(jīng)元缺氧缺糖模型中檢測了MHCⅠ類分子表達變化;接著利用生物信息學(xué)

3、方法篩選能與小鼠MHCⅠ類分子H-2Kb、H-2Db均能高親和結(jié)合的肽;驗證該肽的特異性及親和性后，利用體外神經(jīng)元OGD模型探索修飾肽的結(jié)合模式;在小鼠腦缺血卒中模型中以MHCⅠ類分子靶向性探針進行活體成像，獲得如下結(jié)果:
　　1、在小鼠MCAO卒中模型中，缺血6小時、24小時缺血側(cè)腦組織MHCⅠ類分子顯著強于對側(cè)腦組織;在小鼠光化學(xué)法誘導(dǎo)皮層缺血卒中模型中，我們發(fā)現(xiàn)3小時組MHCⅠ類分子表達量最高，在24小時內(nèi)隨著時間點的推移，

4、上調(diào)表達幅度逐漸降低。且發(fā)現(xiàn)在兩種缺血卒中模型檢測的各時間點，Western blot檢測缺血側(cè)MHCⅠ類分子表達量均高于對側(cè)，MHCⅠ類分子的55KDa條帶差異比45KDa更顯著。原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元OGD模型發(fā)現(xiàn)MHCⅠ類分子在缺氧2小時或4小時后，在復(fù)氧24小時內(nèi)，隨著復(fù)氧時間的延長，表達量逐漸升高。以上結(jié)果提示體內(nèi)及體外缺氧模型中誘導(dǎo)表達MHCⅠ類分子的機制可能不一致。MHCⅠ類分子在缺血性腦卒中發(fā)病后超急性期（發(fā)病6小時內(nèi)）顯著

5、上調(diào)表達的模式，提示該分子可以作為缺血性腦卒中早期成像的潛力靶標(biāo)。
　　2、生物信息學(xué)方法篩選獲得小鼠H-2Kb/H-2Db靶向多肽——H2BP，以人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)方法預(yù)測H2BP與H-2Kb的親和力為51nM，與H-2Db的親和力為3nM。H2BP-MHCⅠ復(fù)合體/gp33-MHCⅠ復(fù)合體與CNS可能配體Ly49A分子對接及打分后，預(yù)測H2BP-MHCⅠ復(fù)合體、gp33-MHCⅠ復(fù)合體分別引起的Ly49A通路活化狀況可能與

6、外周免疫系統(tǒng)TCR通路的情況類似，即H2BP-MHCⅠ對Ly49A分子的親和力低于gp33-MHCⅠ復(fù)合體。以上結(jié)果提示H2BP肽能夠與MHCⅠ類分子發(fā)生緊密結(jié)合;且在H2BP肽-MHCⅠ復(fù)合體與CNS受體相互作用中，MHCⅠ類分子抗原結(jié)合槽內(nèi)的H2BP肽可能具有重要的影響。
　　3、流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-H2BP與兩種品系小鼠來源的脾細胞結(jié)合百分比差異明顯，C57BL/6脾細胞陽性率明顯高于Bab1/c脾細胞，說明本

7、研究所用FITC-H2BP能夠較好的區(qū)分H-2Kb、H-2Db分子與H-2Kd、H-2Dd分子。進一步以H-2Kb-/-Db-/-小鼠與C57BL/6野生型小鼠脾細胞進行流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC-H2BP肽在兩組小鼠的流式檢測中也存在明顯差異，而FITC-control peptide則不能體現(xiàn)出組間差別。OGD模型成像結(jié)果證明，F(xiàn)ITC-H2BP肽與Tuj1標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)合能力明顯強于FITC-control peptide組，說明

8、缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元表達的MHCⅠ類分子具有抗原遞呈功能，且FITC-H2BP肽能夠以競爭低親和及中等親和表位肽的形式與神經(jīng)元表面誘導(dǎo)上調(diào)表達的MHCⅠ類分子特異性結(jié)合。細胞毒性實驗證明Cy5.5-H2BP近紅外熒光成像分子探針對神經(jīng)元毒性低，說明Cy5.5-H2BP近紅外熒光成像分子探針能夠用于缺血性腦卒中模型小鼠的活體成像研究。
　　4、在小鼠光化學(xué)法誘導(dǎo)皮層缺血卒中模型的活體成像研究中，結(jié)果顯示FITC-H2BP探針在小鼠缺血側(cè)半

9、腦有明顯強于對側(cè)半腦的信號分布。Cy5.5-H2BP探針在腦缺血性卒中模型小鼠活體近紅外熒光信號分布結(jié)果顯示，探針尾靜脈注射5小時后，Cy5.5-H2BP分子探針在缺血側(cè)半腦有明顯強于對側(cè)半腦的信號分布，而對照探針Cy5.5-Control組在缺血側(cè)/對側(cè)未見明顯的熒光信號差異。離體腦組織及心肺等主要臟器組織近紅外熒光信號檢測的結(jié)果表明，與對照探針Cy5.5-Control相比，Cy5.5-H2BP不僅在腦組織具有更強的熒光信號，同時腦

10、組織熒光信號強度遠高于心、肝、肺組織的熒光信號強度，進一步說明Cy5.5-H2BP近紅外熒光成像分子探針在腦缺血小鼠體內(nèi)具有良好的缺血腦組織靶向性。
　　5、神經(jīng)元OGD誘導(dǎo)TLR4分子主要表達于神經(jīng)元胞體及樹突;MD2MP肽能夠特異性結(jié)合小鼠細胞表面的TLR4分子，對于LPS或OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元TLR4通路活化MD2MP肽均有靶向抑制效應(yīng);在OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中，MD2MP有明顯的挽救作用，并且MD2MP肽對缺血性腦卒中小鼠