煙堿型乙酰膽堿受體異質(zhì)化在膿毒癥致骨骼肌對非去極化肌松劑敏感性下降中的作用及機制研究.pdf

1、目的：研究不同病程階段的膿毒癥對非去極化肌松劑（Non-depolarizing neuromuscular block agents，NMBA）量效及時效的影響;從神經(jīng)肌接頭（neuromuscular junction，NMJ）突觸后膜煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)的異質(zhì)化探討膿毒癥導(dǎo)致NMBA藥理學變化的機制;驗證蛋白酶抑制劑烏司他丁改善NMBA藥效作用的有效性以

2、及對NMJ突觸后nAChR異質(zhì)化的作用。
　　方法：
　　第一部分：
　　選擇健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠66只，鼠齡2～3月，體重200～220 g，隨機分為正常組（Normal組，n=6）、假手術(shù)組（Sham組，n=6）以及膿毒癥組（Sepsis組）。Normal組大鼠不予任何處理。Sham組大鼠僅行開腹盲腸探查，不予盲腸結(jié)扎。Sepsis組大鼠通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligatio

3、n and puncture，CLP)構(gòu)建膿毒癥模型。在建模（Sepsis組）或手術(shù)（Sham組）后第1天（Day1組，n=6）、第3天（Day3組，n=6）、第7天（Day7組，Sham組中n=6，Sepsis組中n=12）以及第14天（Day14組，Sham組n=6，Sepsis組n=12）進行指標檢測和標本采集。按劑量累計法給予非去極化肌松劑維庫溴銨(初始劑量為0.05 mg/kg，以0.1 mg/kg為遞增劑量，最大劑量達到1

4、mg/kg)。以0.1Hz頻率刺激坐骨神經(jīng)，檢測單次肌顫搐收縮力，計算維庫溴銨的最大單次肌顫搐抑制百分率(％)，以相應(yīng)劑量擬合量效曲線。通過軟件得到維庫溴銨的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)和95％有效抑制濃度(IC95)。最后單次給予2×1C95的維庫溴銨，記錄藥物起效時間、維持時間以及恢復(fù)時間。
　　第二部分：
　　選擇健康成年雄性SD大鼠60只，鼠齡2～3月，體重200～220 g，隨機分為Sham組以及Sepsis組。S

5、epsis組大鼠通過CLP構(gòu)建膿毒癥模型。Sham組大鼠僅行開腹盲腸探查術(shù)，不予盲腸結(jié)扎。各組分別在建模后1天（Day1組，n=6）、3天（Day3組，n=6）、7天（Day7組，Sham組中n=6，Sepsis組中n=12）以及14天（Day7組，Sham組中n=6，Sepsis組中n=12）進行指標檢測和標本采集。各組大鼠分別在建?；蚴中g(shù)前、后檢測脛前肌復(fù)合肌動作電位(Compound muscle actionpotential，

6、CMAP)，測定其波幅和時程，計算運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(Motornerve conduction velocity，MCV)，同時測定單次肌顫搐收縮力。取大鼠脛前肌組織，運用免疫組化和免疫熒光法測定γ-nAChR和α7-nAChR在骨骼肌細胞膜上的表達和分布;通過western-blot測定這兩種蛋白表達量;采用RT-PCR法測定γ和α7功能亞基mRNA的表達水平;取L4～L5節(jié)段脊髓前角神經(jīng)組織，通過western-blot測定neur

7、egulin-1蛋白表達量。
　　第三部分：
　　選擇健康成年雄性SD大鼠24只，鼠齡2～3月，體重200～220 g，隨機分為生理鹽水對照組（0.9％N.S組，n=12）和烏司他丁組（Ulinastatin組，n=12）。各組大鼠通過CLP構(gòu)建膿毒癥模型，在建模后第10天靜脈給予烏司他丁5000 u/kg（Ulinastatin組）或給予等容量0.9％N.S（0.9％N.S組），每天1次，連續(xù)3天。各組大鼠在建模后第14天

8、進行指標檢測和標本采集。維庫溴銨藥效學研究同實驗第一部分方法。神經(jīng)電生理檢測和蛋白檢測檢測同實驗第二部分。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　(1)Sham組各亞組維庫溴銨IC50與Normal組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sepsis組中，Day1組維庫溴銨IC50與Normal組和Sham組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余各組與Normal組和Sham組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

9、。Sham組各亞組之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sepsis組各亞組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); Sepsis組和Sham組在建模/手術(shù)后同一時間的亞組比較，除Day1組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)Normal組與Sham組各亞組的起效時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Sham組各亞組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.0

10、5）。 Sepsis組中，Day1組維庫溴銨起效時間與Normal組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組與Normal組比較，差異均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在建模后同一時間組比較，Sepsis組的Day1組和Sham組的Day1組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余時間組比較，差異均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　Normal組與Sham組各亞組的維持時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Sham組各

11、亞組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sepsis組中，Day1組維庫溴銨維持時間與Normal組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余各組與Normal組比較，差異均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在建模后同一時間組比較，Sepsis組和Sham組的維持時間在Day1差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余時間組比較，差異均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　Normal組與Sham組各亞組的恢復(fù)時間比較，差異無統(tǒng)計

12、學意義(P＞0.05)。Sham組各亞組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sepsis組中，Day1組維庫溴銨恢復(fù)時間與Normal組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余各組與Normal組比較，差異均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。在建模后同一時間組比較，Sepsis組和Sham組的恢復(fù)時間在Day1差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余時間組比較，差異均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　第二部分：
　　

13、(1)Sham組各亞組的CMAP幅值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Sepsis組各亞組的CMAP幅值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Day1組幅值最高，Day14組CMAP幅值最低。Sepsis組和Sham組在建模后同一時間組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　Sham組各亞組的CMAP時程比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Sepsis組各亞組的CMAP時程比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

14、Day14組時程最長，Day1組CMAP時程最短。Sepsis組和Sham組在建模后同一時間組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　Sham組各亞組的MCV比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Sepsis組各亞組的CMAP幅值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Day1組MCV最高，Day14組MCV最低。Sepsis組和Sham組在建模后同一時間組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2) Sha

15、m組各亞組的肌顫搐收縮力比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Sepsis組各亞組的肌顫搐收縮力比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Day1組肌顫搐收縮力最高，Day14組肌顫搐收縮力最低。Sepsis組和Sham組在建模后同一時間組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(3)與Sham組比較，膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14組的大鼠骨骼肌γ-nAChR蛋白表達逐漸增高;在膿毒癥建模后14天，γ-nA

16、ChR蛋白表達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。γ-nAChR蛋白分布于骨骼肌細胞膜上。γ-nAChR功能亞基γ亞基mRNA表達的變化趨勢與蛋白表達變化趨勢一致。與Sham組比較，膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14的大鼠骨骼肌α7-nAChR蛋白表達逐漸增高;在膿毒癥建模后14天，α7-nAChR蛋白表達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。α7-nAChR功能亞基α7亞基mRNA表達的變化趨勢與蛋白表達變化趨勢一

17、致。
　　(4)與Sham組比較，Sepsis組各組的大鼠骨骼肌終板膜增高;膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14組的大鼠骨骼肌終板膜比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著膿毒癥模型建模時間越長，終板膜的面積逐漸增加。
　　(5)與Sham組比較，膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14組的大鼠脊髓背角神經(jīng)元的neuregulin-1蛋白表達降低;在膿毒癥建模后14天，neuregulin-1蛋白表達

18、達到最低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著膿毒癥模型建模時間越長，neuregulin-1蛋白表達逐漸降低。
　　第三部分：
　　(1) Ulinastatin組大鼠脛前肌CMAP的幅值和神經(jīng)傳導(dǎo)速度與0.9％N.S組大鼠比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而時程比較，兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(2)Ulinastatin組大鼠脛前肌單次肌顫搐收縮力高于0.9％N.S組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義

19、(P＜0.05)。
　　(3)與0.9％N.S組比較，Ulinastatin組大鼠脛前肌γ-nAChR蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同樣，Ulinastatin組大鼠脛前肌γ-nAChR功能亞基γmRNA表達水平低于0.9％N.S組(P＜0.05)。與0.9％N.S組比較，Ulinastatin組大鼠脛前肌α7-nAChR蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ulinastatin組大鼠脛前肌α7-nA

20、ChR功能亞基α7 mRNA表達水平低于0.9％N.S組(P＜0.05)。
　　(4)與0.9％N.S組比較，Ulinastatin組大鼠脊髓背角神經(jīng)元neuregulin-1蛋白表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)膿毒癥導(dǎo)致骨骼肌對非去極化肌松劑敏感性下降，表現(xiàn)為肌松作用下降，肌松起效時間延長，維持時間和恢復(fù)時間縮短。同時，膿毒癥導(dǎo)致神經(jīng)肌肉功能障礙，骨骼肌收縮力下降，復(fù)合肌動作電位幅

21、值降低，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，發(fā)生脫髓鞘改變;
　　(2)膿毒癥導(dǎo)致骨骼肌細胞膜上胎兒型乙酰膽堿受體γ-nAChR和神經(jīng)型乙酰膽堿受體α7-nAChR表達升高，并分布于骨骼肌整個細胞膜。膿毒癥的非去極化肌松劑的肌松作用下降與這兩種非成熟型nAChR受體的表達有關(guān);
　　(3)蛋白酶抑制劑烏司他丁可抑制膿毒癥導(dǎo)致的骨骼肌細胞膜上γ-nAChR和α7-nAChR的表達上調(diào)，促進神經(jīng)肌肉功能的恢復(fù)，改善骨骼肌對非去極化肌松劑的敏感性。