ARPIL及其阻斷BCMA-Fc的表達(dá),純化和功能研究.pdf

1、TNF超家族在細(xì)胞增殖、分化、死亡中起著十分重要的作用。其主要成員TNFa,TNFb(LTa),LTb,TRAIL,FAS配體等,在免疫調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答中的作用已被廣泛認(rèn)識。增殖誘導(dǎo)配體APRIL和B淋巴細(xì)胞刺激因子BAFF(又名:Blys)是TNF配體超家族新近發(fā)現(xiàn)的兩個關(guān)系密切的成員。通過與其受體BAFF-R,BCMA,TACI相互作用,在B淋巴細(xì)胞生長、分化和發(fā)育,抗體類型轉(zhuǎn)換、生發(fā)中心維持、T細(xì)胞共刺激等方面發(fā)揮著重要的作用。

2、r>　　 BAFF/APRIL系統(tǒng)(BAFF,APRIL和它們的受體)在自身免疫性疾病和B淋巴細(xì)胞系惡性腫瘤的發(fā)生和維持過程中發(fā)揮重要的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,多發(fā)性硬化以及一些惡性腫瘤中,BAFF和APRIL表達(dá)水平升高。BAFF/APRIL系統(tǒng)成為研究治療自身免疫性疾病藥物的新的靶點。
　　 我們構(gòu)建pET41a-APRIL原核表達(dá)載體,在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中加入葡萄糖,乳糖,形成APRIL自動誘導(dǎo)表達(dá)

3、系統(tǒng),在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了高密度誘導(dǎo)GST—APRIL的可溶性表達(dá),與傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)相比顯著提高外源蛋白的可溶性。通過原位酶切,成功純化得到成熟的r-APRIL,產(chǎn)率約為20mg/L,純度大于80％?；钚詸z測顯示,APRIL具備受體BCMA結(jié)合能力,并可以促進(jìn)RajiB淋巴細(xì)胞瘤的增殖。為后續(xù)研究APRIL功能和其阻斷劑打下良好的基礎(chǔ)。
　　 通過計算機(jī)模擬構(gòu)建BCMA—FC蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型,通過分子對接預(yù)測BCMA—F

4、c具備APRIL,結(jié)合能力。構(gòu)建pPIC9K酵母表達(dá)載體,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母后,通過營養(yǎng)缺陷和G418抗性兩步篩選,獲得高表達(dá)轉(zhuǎn)化子,使用畢赤酵母表達(dá)BCMA—Fc融合蛋白,經(jīng)過超濾濃縮,分子篩和rProteinA親和層析,得到BCMA—Fc融合蛋白,產(chǎn)率為10mg/L,純度大于80％,活性檢測證實BCMA-Fc具備配體APRIL結(jié)合能力,同分子對接的結(jié)果一致。BCMA—Fc在體內(nèi)作為欺騙受體可以抑制APRIL的生物活性,有望成為治療自身免