小鼠β-酪蛋白基因重組體構建、表達及其產(chǎn)物的純化和酶解液的免疫功能研究.pdf

1、研究背景:乳源性的β-酪蛋白(β-CN)含有豐富的生物活性肽，這些生物活性肽在體內(nèi)發(fā)揮著各式各樣的生理功能，因此，β-酪蛋白被譽為乳蛋白中的戰(zhàn)略活性蛋白。制備和提取β-酪蛋白為研究β-酪蛋白及其中包含的生物活性肽具有重要的意義，也為開發(fā)乳品奠定一定基礎。傳統(tǒng)方法獲得β-酪蛋白主要是從乳中分離純化，但獲得的β-酪蛋白產(chǎn)量較低，且分離純化難度較大，為β-酪蛋白的研究和開發(fā)帶來不便。隨著生物技術飛速發(fā)展，利用基因工程手段直接獲得β-酪蛋白為人

2、們提供了新的思路和方法。各種哺乳動物和人β-酪蛋白高度保守，尤其小鼠β-酪蛋白與人的β-酪蛋白又有很高的同源性，本研究以小鼠β-酪蛋白作為研究對象。 目的:構建小鼠β-酪蛋白基因重組體，在大腸桿菌內(nèi)誘導其表達，純化β-酪蛋白并研究其酶解液的部分功能。 方法:從哺乳期小鼠乳腺組織提取總RNA，通過RT-PCR獲得β-酪蛋白基因編碼序列，再與融合蛋白表達載體pGEX-KG連接，構建原核表達質粒pGEX-KG-β-CN，將

3、其轉化到E．coli DH5α宿主內(nèi)，在20℃，用低濃度的IPTG進行長時間的誘導，超聲破碎細菌后SDS-PAGE分析。利用β-酪蛋白基因重組體表達的融合蛋A氨基端帶有GST標簽，用商品化的GST beads(Glutathione Sepharose 4B)，親和層析的方法純化β-CN融合蛋白。以純化的β-CN融合蛋白為底物，用胰蛋白酶、糜蛋白酶作用底物60min、90min、120min、150min，得到不同時間段的酶解液。通過體

4、內(nèi)和體外兩系列實驗，觀察了β-CN融合蛋白酶解液對大鼠和小鼠淋巴細胞轉化的影響。 結果:經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實所構建的質粒pGEX-KG-β-CN，SDS-PAGE證實誘導表達后所獲得的融合蛋白分子量為52KD，表達量占菌體蛋白的12.4％R主要存在于上清液中。純化后產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶、糜蛋白酶作用90min、120min，其對大鼠和小鼠淋巴細胞轉化有明顯的促進作用。 結論:成功構建重組表達質粒pG