重組人BMP-4-7復(fù)合基因腺病毒轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs并誘導其向類髓核細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：(1)對SD大鼠骨髓間質(zhì)干細胞(BMSCs)進行體外培養(yǎng)及傳代，觀察BMSCs的生長特點及生物學特點。(2)rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7復(fù)合基因腺病毒的擴增及病毒滴度測定。(3)將rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7復(fù)合基因以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染BMSCs，觀察其表達。(4)觀察轉(zhuǎn)染對BMSCs增殖、分化及功能的影響。
　　方法：(1)取4周齡SD大鼠(雌雄不分)股骨、脛骨骨髓行密度梯度離心法

2、分離培養(yǎng)BMSCs，取第3代細胞進行轉(zhuǎn)染。(2)利用HEK293T細胞擴增已用GFP標記的rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7復(fù)合基因腺病毒并測定病毒滴度。(3)實驗分成4組：A組：轉(zhuǎn)染rhBMP-4基因腺病毒組；B組：轉(zhuǎn)染rhBMP-7基因腺病毒組；C組：轉(zhuǎn)染rhBMP-4/7復(fù)合基因腺病毒組；D組：空白對照組。(4)于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21d行組織學及免疫組化學觀察；于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4d、14d、21d行PCR檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白

3、、蛋白聚糖基因的表達。
　　結(jié)果：(1)液相倒置顯微鏡下觀察，細胞接種之初，培養(yǎng)瓶中細胞較多，隨著培養(yǎng)時間延長可見細胞貼壁生長，其中有少量呈成纖維細胞樣外形的貼壁細胞，以后這些細胞呈克隆生長。HE染色后光鏡下觀察，培養(yǎng)的BMSCs呈梭形、多角形，有多個突起，胞漿淡藍色，含有較大的顆粒，細胞核可見數(shù)個深藍色的核仁，細胞分裂相多見。(2)病毒保存液MOI值為50～100。測得腺病毒滴度為5×106PFU/mL。(3)腺病毒轉(zhuǎn)染BMSC

4、s后24小時即可見綠色熒光蛋白(GFP)表達，而后逐漸增加，約6-7天表達趨于穩(wěn)定。病毒MOI值為100時感染SD大鼠BMSCs效率較高，且不影響細胞正常增殖，細胞較少出現(xiàn)病理現(xiàn)象，細胞活性無明顯降低。(4)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21d，細胞球直徑約為1mm。A、B、C組HE染色示細胞呈軟骨細胞樣形態(tài)，甲苯胺藍染色呈陽性；D組陰性；轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21d，A、B、C組Ⅱ型膠原蛋白表達呈陽性，但C組染色較A、B組深；D組肉眼基本不可見。PCR檢測示：Ⅰ型膠

5、原蛋白表達量隨培養(yǎng)時間延長A、B、C組均增加，且各組間無差異性(P>0.05)，Ⅱ型膠原蛋白表達在同一培養(yǎng)時間A組優(yōu)于B組而次于C，培養(yǎng)14d、21d無差異，蛋白聚糖表達在同一培養(yǎng)時間B組優(yōu)于A組而次于C，培養(yǎng)14d、21d無差異。
　　結(jié)論：rhBMP-4能增加轉(zhuǎn)染后BMSCsⅡ型膠原蛋白的表達，rhBMP-7能增加轉(zhuǎn)染后BMSCs蛋白聚糖的表達；rhBMP-4/7復(fù)合基因可能具有協(xié)同作用同時增加轉(zhuǎn)染后BMSCs蛋白聚糖和Ⅱ型膠