bFGF、BMP-12基因序貫轉(zhuǎn)染兔脂肪間充質(zhì)干細胞誘導其向韌帶樣細胞功能分化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　ACL這種關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶在膝關(guān)節(jié)中扮演著關(guān)鍵的角色，有利于維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性、開展正常的活動。由于其極差的自愈能力，損傷后只能通過韌帶移植來修復，雖然修復方法繁多，但臨床遠期療效多不理想，對損傷前交叉韌帶的實驗治療主要集中在細胞的治療上，脂肪干細胞（ADSCs）具有取材容易、微創(chuàng)、細胞繁殖快等突出的優(yōu)勢，所以在韌帶工程種子細胞應(yīng)用方面具有廣闊的市場前景。ADSCs與MSCs均能體現(xiàn)出多向分化的功能，在某個特定環(huán)境中能夠轉(zhuǎn)化

2、為骨、軟骨、脂肪細胞及肌腱等。但植入的ADSCs卻不能較好的修復韌帶受損部位。其中可能的一個原因是局部未含大量能夠?qū)σ浦布毎只a(chǎn)生刺激作用的細胞因子。通過體外試驗研究結(jié)果表明， TGF-β1，bFGF， BMP-12，IGF-1等生長因子具有誘導ADSCs向成纖維細胞分化的潛力，因此能夠通過從局部添加上述因子誘導ADSCs分化為成纖維細胞。但通常來說外源性因子發(fā)揮作用的時間較短、價格不菲。將上述細胞因子轉(zhuǎn)染至ADSCs細胞內(nèi)，由自分泌

3、的方式產(chǎn)生相應(yīng)因子促進ADSCs分化為成纖維細胞，以ADSCs充當種子細胞修復組織韌帶，對于前交叉韌帶損傷的治療具有重要意義。
　　本研究采用BMP-12、bFGF基因轉(zhuǎn)染ADSCs介導其轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，通過聯(lián)合應(yīng)用I型膠原酶消化法、貼壁培養(yǎng)法兩種方法培養(yǎng)ADSCs，我們采用I型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，分離、純化及鑒定脂肪組織內(nèi)含有的干細胞，初步探討其生物學特點。由陽離子脂質(zhì)體對基因轉(zhuǎn)染進行誘導，將BMP-12、bFGF

4、序貫轉(zhuǎn)染至ADSCs，并對表達穩(wěn)定的細胞進行篩選，雙基因聯(lián)合誘導ADSCs向成纖維細胞方向分化，通過蛋白聚糖Aggrecan、COL1a1、COL3a1、Elastin等指標測定來判斷是否穩(wěn)定表達，聯(lián)合應(yīng)用bFGF、BMP-12基因能夠為治療ACL受損提供一定的參考數(shù)據(jù)。
　　研究材料及方法：
　　一、研究動物
　　新西蘭大白兔來自于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學實驗動物部
　　二、研究方法
　　1、培養(yǎng)、鑒定、觀察兔AD

5、SCs及其生物學特性
　?。?）培養(yǎng)ADSCs
　　通過Ⅰ型膠原酶給予消化，采取貼壁培養(yǎng)的形式，對兔脂肪干細胞進行分離及純化，完成體外培養(yǎng)擴增。
　?。?）生物學性狀的觀察
　　MTT法測定第3，6代細胞的生長曲線。
　?。?）鑒定兔ADSCs
　　a.CD44、CD49d、CD106免疫熒光法測定細胞免疫表型。
　　b.誘導成骨細胞:誘導液包括地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉10mm

6、ol/L、抗壞血酸50μmol/L。
　　2、BMP-12、bFGF雙基因序貫轉(zhuǎn)染ADSCs誘導其分化為成纖維細胞的動物研究
　?。?）擴增、純化及鑒定真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1+bFGF+GFP。
　?。?）擴增、純化及鑒定真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1+BMP+RFP-12。
　　（3）構(gòu)建穩(wěn)定表達pcDNA3.1+bFGF+GFP-ADSCs細胞株，經(jīng)RT-PCR法、Western blot法測定bFGF的

7、表達水平。
　　（4）繪制單基因及雙基因轉(zhuǎn)染后的細胞增殖曲線。
　?。?）RT-PCR檢測COL1a1、Elastin的表達。
　　（6）透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。
　　3、Ⅰ型膠原支架復合負載有BMP-12、bFGF基因的ADSCs建立三維組織工程韌帶組織
　　（1）將細胞復合支架進制成冰凍切片進行HE染色。
　?。?）將原代培養(yǎng)的ADSCs及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙基因的ADSCs的細胞株與Ⅰ型膠原復合后行掃描

8、電鏡觀察
　?。?）RT-PCR檢測ADSCs及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙基因的ADSCs的細胞株Aggrecan、COL3a1的表達。
　　結(jié)果：
　　1、兔脂肪干細胞分離、培養(yǎng)成功
　?。?）從兔脂肪中分離提取的細胞具有干細胞的特性，能長期體外培養(yǎng)，生長穩(wěn)定，增殖較快，可以作為組織工程的種子細胞。
　?。?）制作P2代ADSCs的生長曲線圖，結(jié)果表明ADSCs的增殖與細胞增殖軌跡相符，其表現(xiàn)出較快的增殖速度。
　

9、?。?）免疫熒光檢測顯示細胞表達ADSCs表面抗原標志CD44, CD49d， CD44免疫熒光染色陰性。誘導組茜素紅、ALP染色結(jié)果為陽性。
　　2、聯(lián)合應(yīng)用BMP-12、bFGF雙基因，成功將ADSCs介導轉(zhuǎn)化為成纖維樣細胞
　　（1）順利擴增及純化真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1+bFGF+GFP。
　　（2）順利擴增及純化真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1+RFP+BMP-12。
　　（3）雙基因轉(zhuǎn)染BMP-12、

10、bFGF后細胞的增殖能力較強。
　?。?）雙基因轉(zhuǎn)染BMP-12、bFGF后細胞可以穩(wěn)定表達COL1a1、Aggrecan、Elastin、COL3a1，并且和單基因組相比，表達水平更高。
　　（5）雙基因轉(zhuǎn)染后細胞的超微結(jié)構(gòu)提示細胞合成代謝旺盛，細胞功能活躍。
　　3、Ⅰ型膠原生物支架復合負載有BMP-12、bFGF的ADSCs建立三維組織工程韌帶
　?。?）bFGF、BMP-12能夠成功誘導脂肪干細胞復合Ⅰ型

11、膠原支架向成纖維細胞分化。
　?。?）該支架能夠較好符合誘導后的細胞，細胞表現(xiàn)為良好的生長狀態(tài)。
　　結(jié)論：
　　1、原代培養(yǎng)得到的ADSCs具有較強的增殖能力，表現(xiàn)出多向分化的功能， ADSCs能夠充當細胞工程中可行、科學的種子細胞。
　　2、雙基因BMP-12、bFGF轉(zhuǎn)染能夠成功誘導ADSCs分化為成纖維樣細胞。
　　3、雙基因BMP-12、bFGF修飾的ADSCs可以穩(wěn)定表達韌帶樣細胞標記物，如El