基于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的酪氨酸激酶通路蛋白蛋白相互作用檢測試劑的研制.pdf

1、目的:
　　本研究實驗構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒。并將重組真核表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)，并且對光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，最后利用AlphaLISA技術(shù)對JAK1蛋白質(zhì)以及通路蛋白的相互作用進(jìn)行檢測，為進(jìn)一步研究JAK1蛋白通路以及疾病的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1 真核表達(dá)JAK1與STAT3
　　1.1 從Hela細(xì)胞中提取總的RNA，通過RT-PCR獲得

2、JAK1與STAT3基因全長cDNA序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體PENTER中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將真核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后檢測蛋白轉(zhuǎn)染和在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　1.2 在表達(dá)過程中進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)化，按照羅氏轉(zhuǎn)染試劑說明書，嚴(yán)格操作進(jìn)行真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別按照質(zhì)粒跟轉(zhuǎn)染試劑比例為i∶1，1∶2與1∶3加入對應(yīng)羅氏轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混合，靜置30min后，緩慢滴加入細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。最后用免疫印跡方法顯示結(jié)果，

3、建立出最佳的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例。
　　1.3 在表達(dá)過程中進(jìn)行轉(zhuǎn)染時間的優(yōu)化，在最佳轉(zhuǎn)染試劑用量的前提下，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h，36h，48h后收細(xì)胞裂解液，利用免疫印跡方法顯示結(jié)果，建立最佳的轉(zhuǎn)染時間。
　　1.4 利用免疫共沉淀檢測JAK1與STAT3的相互作用，收集JAK1與STAT3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞裂解液，用STAT3的抗體進(jìn)行反應(yīng)，免疫印跡用JAK1的抗體進(jìn)行檢測。
　　2 光激

4、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的建立與優(yōu)化
　　采用AFP靶標(biāo)雙抗體夾心法建立并優(yōu)化光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑。
　　2.1 參考標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液(7.5％ BSA、0.9％NaCl、50mmol/L Tris-HCl、0.05％ NaN3、0.01％Tween-20，pH7.8)將AFP抗原配制成0，5，20，125，250，500 U/L系列參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，每瓶1mL分裝凍干4℃保存。
　　2.2 抗體與受體微球連接將0.2

5、 mg的AFP包被抗體加到有濾膜的離心管中，8000g離心6 min，用連接緩沖液pH5.0，0.1 mol/L的MES重復(fù)洗滌6次后，將1mg的受體微球加入到抗體溶液中，再加入10μL25 mg/mL NaBH3CN（用MES配制）、1.25μL10％的Tween-20，用緩沖液MES將體積補充到200μL，放置在37℃避光振蕩孵育48 h。加入用0.8 mol/L NaOH配制的10μL65 mg/mL CMO封閉液封閉未結(jié)合位點，

6、放置37℃避光孵育1h后進(jìn)行洗滌，即能得到已連接抗體的受體發(fā)光微球，將受體發(fā)光微球濃度調(diào)整為5 mg/mL。
　　2.3 抗體與生物素連接將1mg標(biāo)記抗體加入到帶有濾膜的離心管中，以8000g離心6 min。用生物素標(biāo)記緩沖液(0.1 mol/L、pH9.5的Na2CO3/NaHCO3)重復(fù)洗滌6次后，在抗體溶液中加入用二甲亞砜(DMSO)配制的10μL22 mg/mL活化生物素，放置室溫避光振蕩孵育4h后用PBS洗滌，并將其抗體

7、濃度調(diào)整為0.5 mg/mL。
　　2.4 光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)體系反應(yīng)時間的優(yōu)化
　　將反應(yīng)時間設(shè)置梯度10min，15min，30min建立出最佳的反應(yīng)時間;
　　2.5 受體微球連接抗體的量的優(yōu)化
　　保持發(fā)光微球的說明書用量為1mg，將AFP連接抗體制備一系列用量200μg，150μg，125μg，100μg，分別按照以上受體微球連接抗體的方法進(jìn)行連接。向Optiplates微孔板中分別依次加入25μ

8、L受體發(fā)光微球化抗體、25μL生物素化抗體、25μL的AFP抗原，加貼封紙片，放置于37℃恒溫振蕩箱內(nèi)避光振蕩孵育15 min。在黑暗條件下加入175μL鏈霉親和素化的供體感光微球，加貼封紙片。反應(yīng)微孔條在37℃恒溫振蕩箱內(nèi)避光振蕩孵育15 min。放置于檢測儀器2300EnSpireTM上檢測信號值。保持AFP連接抗體用量為125μg的條件下，將受體微球制備成一系列用量1mg，800μg，600μg，400μg，分別按照受體微球連接抗

9、體的方法進(jìn)行連接。把受體微球和AFP抗體的用量同時下調(diào)為之前的1/5，即受體微球用量為200μg，AFP抗體用量為25μg。同時設(shè)置了AFP抗體用量為30μg作為對照組。
　　2.6 生物素化的抗體量的優(yōu)化
　　為了降低連接生物素的抗體的用量，我們將生物素與抗體的用量同時下降一定的比例。建立出最佳的生物素化抗體的量。
　　2.7 不同緩沖液的優(yōu)化
　　為了選擇最佳的反應(yīng)液體環(huán)境，我們把PBS與分析緩沖液做了對比。

10、建立最佳的反應(yīng)緩沖液。
　　3 蛋白質(zhì)相互作用的檢測
　　在光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)體系完成優(yōu)化的條件下。
　　3.1 把JAK1的抗體與感光微球相連接，同時把GHR，IL4R，CSF3R，IL10RA，IL2RB等的抗體連接在發(fā)光微球上。檢測蛋白 JAK1與蛋白GHR，IL4R，CSF3R，IL10RA，IL2RB的相互作用。
　　3.2 把STAT3抗體連接在發(fā)微球上，檢測蛋白JAK1與蛋白STAT3的相互作

11、用。
　　3.3 把JAK2抗體連接在生物素上，檢測蛋白STAT3與蛋白JAK2的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1 經(jīng)PCR，雙酶切鑒定JAK1與STAT3重組質(zhì)粒克隆正確，并且能夠在293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，免疫印跡檢測可在對應(yīng)位置看到目的蛋白，最佳的轉(zhuǎn)染試劑用量是轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒為3∶1，最佳轉(zhuǎn)染時間為48h。
　　2 利用AFP靶標(biāo)建立的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)體系構(gòu)建并且優(yōu)化，15min的反應(yīng)時間熒光置最強;抗

12、體連接受體微球的用量下調(diào)為抗體25μg連接200μg受體微球，跟200μg抗體連接1mg受體微球的熒光值相差不大;生物素連接抗體的用量下調(diào)為抗體25μg，跟130μg抗體連接生物素的熒光值相差不大。
　　3 在優(yōu)化完成的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)體系的前提下，能夠檢測出蛋白JAK1與通路的相互作用，并且能夠檢測出STAT3與JAK2的蛋白相互作用。
　　結(jié)論:
　　成功獲得JAK1與STAT3基因全長序列，并成功構(gòu)建PE

13、NTER-JAK1，PENTER-STAT3的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞293T中獲得有效表達(dá)。并且優(yōu)化出最佳的轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒比例為3∶1，最佳轉(zhuǎn)染表達(dá)時間為48h。利用AFP靶標(biāo)成功構(gòu)建光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)體系，并優(yōu)化出最佳反應(yīng)時間為15min;最佳連接用量為25μg抗體連接200μg受體微球;最佳生物素化抗體用量為25μg抗體連接2.5μg生物素;分析緩沖液作為反應(yīng)緩沖液優(yōu)于PBS。能夠檢測出蛋白JAK1與通路蛋白的相互作用