附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制.pdf

1、研究背景及目的：
　　卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌居第三位，而其致死率卻占首位。卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展較為隱匿，由于卵巢癌早期無(wú)癥狀，缺乏有效的篩查手段，臨床上80％的卵巢癌患者獲得診斷時(shí)已是中晚期，其5年存活率僅為20％～30％，而早期卵巢癌患者5年生存率為70％～90％。卵巢癌早期預(yù)后極好，但晚期只有10％～30％的存活率。因此，早期發(fā)現(xiàn)對(duì)卵巢癌患者非常重要。高靈敏度與高特異度的卵巢

2、標(biāo)致物有助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)，無(wú)疑也將提高卵巢癌的生存率，同時(shí)也有助于治療中的病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后判斷。
　　人附睪分泌蛋白4(HE4)是一種新的、有潛力的卵巢癌標(biāo)志物，在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族，全長(zhǎng)11.78kb。HE4基因最早在人附睪上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)HE4基因與卵巢癌有關(guān)。這一新的血清標(biāo)記物在良性腫瘤患者及正常人血清中

3、含量極低，但在卵巢癌患者血清中含量很高。而日益增多的研究證據(jù)表明，HE4在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。癌抗原125(CA125)自卵巢漿液囊腺癌中提取，是相對(duì)分子質(zhì)量為2×105～10×105的糖蛋白抗原。其在上皮性卵巢癌細(xì)胞中CA125高度表達(dá)，并且能分泌到血液中。CA125是目前臨床應(yīng)用最廣的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物，主要用于卵巢癌的輔助診斷，同時(shí)也作為卵巢癌治療后療效觀察的指標(biāo)和監(jiān)測(cè)病情的手段，臨床實(shí)用價(jià)值較高。盡管

4、大多數(shù)卵巢癌患者血清CA125水平升高，但在這些患者中也僅有不到50％的人在疾病的早期升高。雖然CA125具有較高敏感性，但很多婦科良性疾病患者血清CA125都會(huì)明顯升高，而且不能區(qū)分CA125在生理情況（月經(jīng)期、妊娠期）和一些良性疾?。ㄗ訉m內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫、伴有腹水的肝硬化等）的升高。研究證實(shí)，HE4在卵巢癌組織的表達(dá)明顯高于卵巢正常組織，與以往所使用的標(biāo)志物相比，HE4在卵巢癌的診斷中具有很高的敏感性，尤其是在卵巢癌的Ⅰ期診斷方

5、面。而聯(lián)合檢測(cè)血清中HE4與CA125的水平得到的靈敏度比單獨(dú)使用兩者中的任何一個(gè)都高。
　　標(biāo)記免疫學(xué)，就是將標(biāo)記技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行分析測(cè)定的一門(mén)學(xué)科，是集實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科，其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和各標(biāo)記物的高靈敏可測(cè)量性來(lái)檢查體內(nèi)各種生物活性物質(zhì)的活性和濃度。隨著標(biāo)記技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，標(biāo)記免疫學(xué)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及食品安

6、全檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。目前該方法包括一系列的免疫分析技術(shù):熒光免疫分析(FIA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、膠體金免疫分析(GICA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)等。但這些傳統(tǒng)標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)在應(yīng)用中存在著一些不足。因此，開(kāi)發(fā)新型標(biāo)記免疫技術(shù)非常有必要，一種新型定量免疫分析技術(shù)光激化學(xué)發(fā)光免疫分析（Amplifiedluminescent proximity homogenous im

7、munoassay，AlphaLISA）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)起源于1994年發(fā)明的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)（Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI），隨后美國(guó)PerkinElmer公司研制相關(guān)科研試劑(AlphaScreen?)。作為近年興起的新型定量均相免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，它克服了傳統(tǒng)標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)需洗滌分離結(jié)合標(biāo)記與游離標(biāo)記的缺點(diǎn)。它結(jié)合單線態(tài)氧半衰期短、納米材料和激光技

8、術(shù)等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了在均相中進(jìn)行反應(yīng)的操作過(guò)程。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、背景信號(hào)低、檢測(cè)重復(fù)性好、無(wú)放射性污染、不需分離結(jié)合標(biāo)記與游離標(biāo)記、高通量、易于自動(dòng)化和高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，代表了現(xiàn)在及未來(lái)分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。
　　本研究采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)研制HE4和CA125檢測(cè)試劑并評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo)，同時(shí)與其它檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的可行性。
　　方法:
　　采用

9、雙抗體夾心法研制人附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑。
　　1.受體微球與抗體連接將0.2 mg包被抗體加入到帶有濾膜的離心管中，以5510 g離心5～6 min，用標(biāo)記緩沖液(0.13 mol/L，pH8.0 PBS)重復(fù)洗滌6次后，在抗體溶液中加入1 mg受體微球、10μL25 mg/mL NaBH3CN（用標(biāo)記緩沖液配制）、1.25μL10％ Tween-20，用標(biāo)記緩沖液將體積補(bǔ)充到200μL，37℃避光

10、振蕩反應(yīng)48 h。加入10μL65 mg/mL CMO（用0.8 mol/L NaOH配制）封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37℃避光溫育1h后離心洗滌，得到已連接抗體的受體微球，調(diào)整受體微球濃度為5 mg/mL。
　　2.生物素與抗體連接將0.5 mg標(biāo)記抗體加入到帶有濾膜的離心管中，以5510g離心5～6 min。用標(biāo)記緩沖液(0.1 mol/L Na2CO3/NaHCO3，pH9.5)重復(fù)洗滌6次后，在50μL抗體溶液中加入5μL20 mg

11、/mL活化生物素[用二甲亞砜(DMSO)配制]，室溫避光振動(dòng)孵育4h。利用PBS(pH7.4)4℃透析24 h，每6h換液一次，收集透析袋中液體，并將其抗體濃度調(diào)整為0.5 mg/mL。
　　3.參考標(biāo)準(zhǔn)品的配備用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、7.5％ BSA、0.9％ NaCl、0.05％ NaN3、0.01％ Tween-20，pH7.8）將抗原配制成所需系列濃度，每瓶1ml分裝凍干4℃保存?zhèn)溆谩?br>

12、　　4.試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)
　　4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，信號(hào)值為縱坐標(biāo)，由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。
　　4.2 Hook效應(yīng):對(duì)濃度遞增的多個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)品抗原進(jìn)行測(cè)定。
　　4.3 分析靈敏度:將零值參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量20次，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測(cè)定值的均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值減去本底信號(hào)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　4.4

13、準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn):使用陰性血清將HE4抗原稀釋作為參考樣品，并以自制標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值在0.90-1.10之間作為評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性合格的標(biāo)準(zhǔn)。
　　4.5 精密度實(shí)驗(yàn):采用低、中、高3個(gè)質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)進(jìn)行測(cè)定，得到各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV)。
　　4.6 特異性實(shí)驗(yàn):將一定濃度的干擾物質(zhì)作為樣本檢測(cè)得到的相應(yīng)濃度即為特異性。
　　4.7 回收率實(shí)驗(yàn):在已知濃度的血清樣本中添加不同濃度的

14、純抗原，計(jì)算其理論值及實(shí)測(cè)值的比值，即回收率。
　　4.8 干擾實(shí)驗(yàn):對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其回收率。
　　4.9 與國(guó)外試劑的比較實(shí)驗(yàn):樣本用自制試劑與對(duì)照試劑檢測(cè)后將所測(cè)濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　自制HE4試劑分析靈敏度為0.81 pmol/L，線性范圍內(nèi)，HE4劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)，r2=0.996;稀釋回收率在93％-103％之間;分析內(nèi)和分析間的精

15、密度分別為4.3％-7.2％和6.1％-7.7％，均低于10％; HE4試劑與CA15-3、AFP、CEA和CA125無(wú)交叉反應(yīng)。HE4試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾;134例臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)，進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性良好(r2=0.978，P＜0.0001)。表明本研究研制的試劑有望取代的進(jìn)口檢測(cè)試劑盒用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。
　　自制CA125試劑靈敏度為0.43 U/mL;精

16、密度實(shí)驗(yàn)顯示自制試劑分析內(nèi)分析間變異系數(shù)均低于10％，顯示該系統(tǒng)的精密度較高。特異性結(jié)果顯示與CA15-3、AFP、CEA、HE4、CA19-9和CA50無(wú)明顯交叉反應(yīng)，可見(jiàn)采用的兩株單克隆抗體特異性好。161份臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法測(cè)得的數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性良好（r2=0.992，P＜0.0001），表明本研究研制的試劑有望取代的進(jìn)口檢測(cè)試劑盒用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。
　　結(jié)論: