附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制.pdf

1、研究背景及目的：
　　卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌居第三位，而其致死率卻占首位。卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展較為隱匿，由于卵巢癌早期無癥狀，缺乏有效的篩查手段，臨床上80％的卵巢癌患者獲得診斷時已是中晚期，其5年存活率僅為20％～30％，而早期卵巢癌患者5年生存率為70％～90％。卵巢癌早期預(yù)后極好，但晚期只有10％～30％的存活率。因此，早期發(fā)現(xiàn)對卵巢癌患者非常重要。高靈敏度與高特異度的卵巢

2、標致物有助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)，無疑也將提高卵巢癌的生存率，同時也有助于治療中的病情監(jiān)測、療效評價及預(yù)后判斷。
　　人附睪分泌蛋白4(HE4)是一種新的、有潛力的卵巢癌標志物，在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族，全長11.78kb。HE4基因最早在人附睪上皮細胞中發(fā)現(xiàn)，通過cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)HE4基因與卵巢癌有關(guān)。這一新的血清標記物在良性腫瘤患者及正常人血清中

3、含量極低，但在卵巢癌患者血清中含量很高。而日益增多的研究證據(jù)表明，HE4在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。癌抗原125(CA125)自卵巢漿液囊腺癌中提取，是相對分子質(zhì)量為2×105～10×105的糖蛋白抗原。其在上皮性卵巢癌細胞中CA125高度表達，并且能分泌到血液中。CA125是目前臨床應(yīng)用最廣的卵巢癌腫瘤標志物，主要用于卵巢癌的輔助診斷，同時也作為卵巢癌治療后療效觀察的指標和監(jiān)測病情的手段，臨床實用價值較高。盡管

4、大多數(shù)卵巢癌患者血清CA125水平升高，但在這些患者中也僅有不到50％的人在疾病的早期升高。雖然CA125具有較高敏感性，但很多婦科良性疾病患者血清CA125都會明顯升高，而且不能區(qū)分CA125在生理情況（月經(jīng)期、妊娠期）和一些良性疾?。ㄗ訉m內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫、伴有腹水的肝硬化等）的升高。研究證實，HE4在卵巢癌組織的表達明顯高于卵巢正常組織，與以往所使用的標志物相比，HE4在卵巢癌的診斷中具有很高的敏感性，尤其是在卵巢癌的Ⅰ期診斷方

5、面。而聯(lián)合檢測血清中HE4與CA125的水平得到的靈敏度比單獨使用兩者中的任何一個都高。
　　標記免疫學(xué)，就是將標記技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合進行分析測定的一門學(xué)科，是集實驗技術(shù)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科，其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和各標記物的高靈敏可測量性來檢查體內(nèi)各種生物活性物質(zhì)的活性和濃度。隨著標記技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，標記免疫學(xué)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及食品安

6、全檢測等多個領(lǐng)域。目前該方法包括一系列的免疫分析技術(shù):熒光免疫分析(FIA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、膠體金免疫分析(GICA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)等。但這些傳統(tǒng)標記免疫學(xué)技術(shù)在應(yīng)用中存在著一些不足。因此，開發(fā)新型標記免疫技術(shù)非常有必要，一種新型定量免疫分析技術(shù)光激化學(xué)發(fā)光免疫分析（Amplifiedluminescent proximity homogenous im

7、munoassay，AlphaLISA）技術(shù)應(yīng)運而生。該技術(shù)起源于1994年發(fā)明的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)（Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI），隨后美國PerkinElmer公司研制相關(guān)科研試劑(AlphaScreen?)。作為近年興起的新型定量均相免疫學(xué)檢測技術(shù)，它克服了傳統(tǒng)標記免疫學(xué)技術(shù)需洗滌分離結(jié)合標記與游離標記的缺點。它結(jié)合單線態(tài)氧半衰期短、納米材料和激光技

8、術(shù)等優(yōu)勢，實現(xiàn)了在均相中進行反應(yīng)的操作過程。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有操作簡單、背景信號低、檢測重復(fù)性好、無放射性污染、不需分離結(jié)合標記與游離標記、高通量、易于自動化和高靈敏度等優(yōu)勢，代表了現(xiàn)在及未來分析檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。
　　本研究采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)研制HE4和CA125檢測試劑并評價各項性能指標，同時與其它檢測試劑盒進行比較，評價其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。
　　方法:
　　采用

9、雙抗體夾心法研制人附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑。
　　1.受體微球與抗體連接將0.2 mg包被抗體加入到帶有濾膜的離心管中，以5510 g離心5～6 min，用標記緩沖液(0.13 mol/L，pH8.0 PBS)重復(fù)洗滌6次后，在抗體溶液中加入1 mg受體微球、10μL25 mg/mL NaBH3CN（用標記緩沖液配制）、1.25μL10％ Tween-20，用標記緩沖液將體積補充到200μL，37℃避光

10、振蕩反應(yīng)48 h。加入10μL65 mg/mL CMO（用0.8 mol/L NaOH配制）封閉未結(jié)合位點，37℃避光溫育1h后離心洗滌，得到已連接抗體的受體微球，調(diào)整受體微球濃度為5 mg/mL。
　　2.生物素與抗體連接將0.5 mg標記抗體加入到帶有濾膜的離心管中，以5510g離心5～6 min。用標記緩沖液(0.1 mol/L Na2CO3/NaHCO3，pH9.5)重復(fù)洗滌6次后，在50μL抗體溶液中加入5μL20 mg

11、/mL活化生物素[用二甲亞砜(DMSO)配制]，室溫避光振動孵育4h。利用PBS(pH7.4)4℃透析24 h，每6h換液一次，收集透析袋中液體，并將其抗體濃度調(diào)整為0.5 mg/mL。
　　3.參考標準品的配備用標準品緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、7.5％ BSA、0.9％ NaCl、0.05％ NaN3、0.01％ Tween-20，pH7.8）將抗原配制成所需系列濃度，每瓶1ml分裝凍干4℃保存?zhèn)溆谩?br>

12、　　4.試劑性能指標的評價
　　4.1 標準曲線的繪制:以自制試劑中參考標準品濃度為橫坐標，信號值為縱坐標，由雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。
　　4.2 Hook效應(yīng):對濃度遞增的多個參考標準品抗原進行測定。
　　4.3 分析靈敏度:將零值參考標準品當作樣品測量20次，計算其均值及標準差。以其測定值的均值加上2倍標準差所得信號值減去本底信號值，代入標準曲線方程計算所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　4.4

13、準確度實驗:使用陰性血清將HE4抗原稀釋作為參考樣品，并以自制標準品的實測濃度與理論濃度的比值在0.90-1.10之間作為評價準確性合格的標準。
　　4.5 精密度實驗:采用低、中、高3個質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)進行測定，得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及變異系數(shù)(CV)。
　　4.6 特異性實驗:將一定濃度的干擾物質(zhì)作為樣本檢測得到的相應(yīng)濃度即為特異性。
　　4.7 回收率實驗:在已知濃度的血清樣本中添加不同濃度的

14、純抗原，計算其理論值及實測值的比值，即回收率。
　　4.8 干擾實驗:對加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽性標本進行測定，計算其回收率。
　　4.9 與國外試劑的比較實驗:樣本用自制試劑與對照試劑檢測后將所測濃度值進行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　自制HE4試劑分析靈敏度為0.81 pmol/L，線性范圍內(nèi)，HE4劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)，r2=0.996;稀釋回收率在93％-103％之間;分析內(nèi)和分析間的精

15、密度分別為4.3％-7.2％和6.1％-7.7％，均低于10％; HE4試劑與CA15-3、AFP、CEA和CA125無交叉反應(yīng)。HE4試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾;134例臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒平行檢測，進行相關(guān)性分析，相關(guān)性良好(r2=0.978，P＜0.0001)。表明本研究研制的試劑有望取代的進口檢測試劑盒用于臨床檢測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。
　　自制CA125試劑靈敏度為0.43 U/mL;精

16、密度實驗顯示自制試劑分析內(nèi)分析間變異系數(shù)均低于10％，顯示該系統(tǒng)的精密度較高。特異性結(jié)果顯示與CA15-3、AFP、CEA、HE4、CA19-9和CA50無明顯交叉反應(yīng)，可見采用的兩株單克隆抗體特異性好。161份臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒平行檢測，結(jié)果顯示兩種方法測得的數(shù)值統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性良好（r2=0.992，P＜0.0001），表明本研究研制的試劑有望取代的進口檢測試劑盒用于臨床檢測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。
　　結(jié)論: