基于均相化學發(fā)光法的腫瘤標記物CA125檢測試劑和JAK1與相互作用蛋白分析試劑的研制.pdf

1、目的:
　　采用均相化學發(fā)光免疫分析技術(shù)研制CA125的定量檢測試劑，評價各項性能指標;同時，研制了基于該免疫分析技術(shù)細胞裂解液中分析JAK1和IL-2RB，JAK1和IL-10RA相互作用的核心原料和分析試劑。
　　方法:
　　1.研制CA125的均相化學發(fā)光定量免疫分析試劑
　　1.1 參考標準品的配制:用標準品稀釋液將CA125抗原配置成1，12，34，118，310，670 U/mL系列參考品溶液，每管1

2、 mL于-20℃保存，融化后于4℃保存，避免反復凍融。
　　1.2 抗體與發(fā)光微球的連接:CA125的配對標記抗體200μg加入到超濾管中，以8，000rpm離心6 min，用抗體與受體微球的連接緩沖液洗滌5次。CA125的包被抗體分別取30，50，70，100μg與1 mg發(fā)光微球連接，加入10μL的抗體與受體微球連接溶液，1.25μL的10％ Tween-20，37℃避光震蕩48 h。加入10μL的封閉液封閉結(jié)合位點。37℃避

3、光孵育1h后離心洗滌。將連接抗體的微球溶液調(diào)整濃度為5 mg/mL。
　　1.3 生物素與抗體的連接:將CA125的配對包被抗體100μg加入到超濾管中，以8，000rpm離心6 min，用生物素標記緩沖液洗滌5次，加入0.5μL的22 mg/mL的活化生物素，用生物素標記緩沖液定容至200μL，室溫孵育2h。將連接產(chǎn)物加入超濾管，用生物素保存液洗滌5次，最后收集超濾管中液體，并將濃度調(diào)整至5 mg/mL。
　　1.4 試劑

4、性能指標的評價:包括標準曲線的繪制，靈敏度，特異性實驗，回收率，干擾實驗及與國外試劑盒的比較實驗等。
　　2.研制均相化學發(fā)光定量免疫分析JAK1和IL-2RB，JAK1和IL-10RA相互作用的核心原料和分析試劑
　　2.1 從Hela細胞中提取總RNA，通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄cDNA，擴增IL-2RB，IL-10RA。經(jīng)雙酶切、連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、挑克隆及質(zhì)粒提取，得到重組質(zhì)粒pENTER-IL-2RB-His和pEN

5、TER-IL-10RA-His。
　　2.2 重組質(zhì)粒pENTER-IL-2RB-His和pENTER-IL-10RA-His的PCR、雙酶切、測序鑒定。
　　2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、間接免疫熒光和免疫印跡檢測IL-2RB和IL-10RA蛋白的真核表達。
　　2.4 免疫共沉淀檢測JAK1和IL-2RB、JAK1和IL-10RA的相互作用。
　　2.5 均相化學發(fā)光免疫分析法檢測JAK1-IL-2RB、JAK1-

6、IL-10RA的蛋白相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.自制的CA125均相化學發(fā)光免疫分析試劑的分析靈敏度為0.29 U/mL。分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為4.4％-6.8％，9.9％-12.7％。自制試劑臨床血清樣本值與化學發(fā)光法的測值具有良好的相關(guān)性。
　　2.經(jīng)PCR、雙酶切鑒定IL-2RB和IL-10RA重組質(zhì)粒為陽性克隆，并且在293T細胞中成功表達，免疫印跡可在對應(yīng)的位置看到目的蛋白條帶。
　　3.基

7、于CA125均相化學發(fā)光免疫分析技術(shù)，當受體發(fā)光微球連接抗體為30μg時，能夠檢測出JAK1-IL-2RB，JAK1-IL-10RA的相互作用。
　　結(jié)論:
　　自制的CA125均相化學發(fā)光免疫分析試劑的各項指標均達到檢測試劑的要求，為研制腫瘤標記物CA125試劑盒提供了核心原料，也為其他均相化學發(fā)光免疫分析試劑的研制提供了技術(shù)支持。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pENTER-IL-2RB-His和pENTER-IL-10RA-His，