人源N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(OGA)的原核表達(dá)、催化機(jī)理研究及多克隆抗體的制備.pdf

1、0-連接N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAe)修飾廣泛地存在于真核生物中，對細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)蛋白的Ser/Thr進(jìn)行單糖基化修飾，與磷酸化相似，是一種廣泛、動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，參與基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解等多種生命活動的調(diào)控。O-GIcNAc修飾水平與多種疾病，如II型糖尿病、老年神經(jīng)退行性疾病以及和癌癥的發(fā)生都有密切關(guān)系。
　　 蛋白上O-GIcNAc的添加和移除分別是由β-N-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和β

2、-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)催化完成的。為闡明OGA催化的機(jī)理和對O-GIcNAc修飾的調(diào)控機(jī)制，我們通過PCR克隆了人源OGA cDNA基因的三個片段：全長foga(編碼1-916 aa)，yoga(編碼1-677 aa)及soga(編碼1-350 aa)，并分別連入原核表達(dá)載體pET-28a中，在大腸桿菌BL21菌株中分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)時間等，找到了最優(yōu)的誘導(dǎo)條件，使得各OGA

3、片段的表達(dá)量及可溶性都得到了改善。按照優(yōu)化后的條件對三種OGA片段進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，并通過Ni柱親和純化得到了純度較好的目的蛋白，能夠用于生化研究和酶活測定。
　　 以4-甲基傘形酮-乙酰氨基葡萄糖(4-MU-GIcNAc)為底物，分別測定三種純化后的OGA片段的β-N-乙酰葡萄糖糖苷酶活性，結(jié)果顯示三種OGA片段均具有活性，fOGA、vOGA、sOGA的‰值依次增大，Kcat值依次減小，表明N端結(jié)構(gòu)域即sOGA是糖苷酶活性中

4、心，能夠獨立發(fā)揮催化功能；C端結(jié)構(gòu)域可以穩(wěn)定全長蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并對糖苷酶活性的發(fā)揮有著重要的輔助作用。但C端結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)制仍有待于OGA結(jié)構(gòu)的解析。
　　 確定sOGA具備獨立催化能力之后，我們利用已解析的OGA同源結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行同源建模，得到了sOGA的三維結(jié)構(gòu)模型；通過分子對接，模擬出OGA抑制劑PUGNAc與活性中心的相互作用模型；并根據(jù)該模型得到了7個可能在催化過程中起關(guān)鍵作用的氨基酸：Y69、D174、D175、Y2

5、19、C215、N280、D285。利用定點突變PCR的方法，我們分別對其進(jìn)行突變：Y69F、D174N、D175N、C215A、Y219F、N280A、N285A，將不同的突變體進(jìn)行克隆表達(dá)、純化和酶活測定，實驗結(jié)果顯示各突變體的活性均較野生型有不同程度(4-2000倍)的降低，表明各氨基酸均在OGA發(fā)揮催化功能過程中發(fā)揮重要的作用，該實驗為深入研究OGA的催化機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步研究OGA的體內(nèi)生物學(xué)作用，我們以純化的sOGA