菜青蟲N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質(zhì)研究.pdf

1、比較菜青蟲不同部位及不同生長(zhǎng)期的菜青蟲N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase，EC3.2.1.52)的比活力，發(fā)現(xiàn)五齡幼蟲表皮來(lái)源的NAGase比活力最高。通過(guò)解剖獲得五齡菜青蟲表皮，用0.05 mol/LPBS含0.1 mol/LNaCl緩沖液(pH=6.8)抽提、硫酸銨分級(jí)分離獲得粗酶，并進(jìn)一步通過(guò)Sephadex G-200凝膠過(guò)濾柱層析和羥基磷灰石柱層析(CHT Ⅱ柱)純化獲得比活力為8715 u/mg的聚丙烯酰胺凝膠電

2、泳單一純NAGase酶制劑。采用凝膠過(guò)濾柱層析法測(cè)定該酶的分子量約為106 kD。通過(guò)SDS-PAGE方法測(cè)定NAGase含兩個(gè)異型亞基，分子量分別為59.5和57.2 kD。該酶不含寡糖。 以對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)為底物，測(cè)得該酶在0.1 mol/LPBS緩沖液中催化水解底物pNP-NAG的最適pH為6.2，最適溫度為42℃；在37℃、pH6.2PBS中，該酶催化pNP-NAG水解的米氏常數(shù)

3、K<,m>為0.326mmol/L，反應(yīng)的活化能為83.86 KJ/mol。該酶在45℃以下，pH4-9范圍內(nèi)穩(wěn)定。 以動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定酶活性功能基團(tuán)的解離性質(zhì)，39℃下測(cè)得菜青蟲NAGase酶活性中心可解離基團(tuán)解離常數(shù)pK<,e>值為5.20，標(biāo)準(zhǔn)解離熱焓△H<'o>為2.18kcal/mol，表明該酶的活性中心的可解離基團(tuán)是谷氨酸或天冬氨酸的側(cè)鏈羧基?；瘜W(xué)修飾法研究進(jìn)一步證明側(cè)鏈羧基是酶的必需基團(tuán)，并測(cè)定出酶活性必需的羧基數(shù)為

4、一個(gè)。修飾劑對(duì)該酶的化學(xué)修飾研究還表明半胱氨酸巰基、色氨酸的吲哚基、組氨酸的咪唑基、二硫鍵也是酶活性的必需基團(tuán)。而精氨酸殘基及賴氨酸ε-氨基被修飾后對(duì)酶活力沒(méi)有影響，不是酶的必需基團(tuán)。 通過(guò)對(duì)產(chǎn)物NAG與產(chǎn)物pNP的類似物苯酚對(duì)酶的抑制作用研究表明酶催化底物pNP-NAG水解反應(yīng)屬有序雙雙機(jī)理。 通過(guò)對(duì)變性劑鹽酸胍和脲的作用下菜青蟲NAGase活力和構(gòu)象變化的比較表明酶的活力變化快于構(gòu)象變化。說(shuō)明該酶分子的活性中心處于對(duì)

5、變性劑較敏感的區(qū)域，即活性部位具有柔曲性。 比較酶經(jīng)熱失活后活力與構(gòu)象變化間的關(guān)系，也得到酶活力喪失明顯快于其構(gòu)象的結(jié)果。通過(guò)失活動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定熱失活速度常數(shù)得到自由酶的熱失活速度常數(shù)(K<,+0'>)明顯大于酶.底物絡(luò)合物的失活速度常數(shù)(K<,+0'>)，說(shuō)明底物與酶的結(jié)合對(duì)酶的熱失活作用有一定的保護(hù)作用。 金屬離子對(duì)菜青蟲NAGase活力影響的研究表明Mg<'2+>對(duì)酶有輕微的激活作用，Ba<'2+>有輕微的抑制作用

6、，Cu<'2+>、Zn<'2+>和Hg<'2+>對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。Cu<'2+>和Hg<'2+>在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)酶的抑制作用是競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制作用。有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、甲醛、二甲亞砜對(duì)NAGase活力均有不同程度的影響，其中甲醛的作用較強(qiáng)。除了精氨酸對(duì)酶有一定抑制作用，其它氨基酸對(duì)酶活力幾乎沒(méi)有影響。產(chǎn)物NAG的類似物葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、蔗糖(SUC)對(duì)酶均有抑制作用，葡萄糖和半乳糖對(duì)酶的抑制作用為混合

7、型，蔗糖的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)型。 通過(guò)對(duì)部分天然化合物及其衍生物以及某些植物粗提物對(duì)菜青蟲NAGase抑制效應(yīng)的研究，結(jié)果表明CPC的抑制效果最顯著，6 mmol/L 的濃度即可使酶活性幾乎喪失。茴香酸和苯甲酸衍生物對(duì)該酶有一定的抑制效果，6 mmol/L 的抑制率分別為35﹪和27﹪，其它的化合物的抑制作用均不佳。而植物粗提物抑制作用的研究表明，分別通過(guò)水抽提的十多種植物抽提物中，用水抽提的貓爪藤、側(cè)柏葉、烏桕、銀杏外種皮有較強(qiáng)