版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V)是存在于高爾基體中的N糖鏈外鏈加工酶,催化UDP-GlcNAc中GlcNAc轉(zhuǎn)移到N糖鏈五糖核心上α甘露糖(aman)形成β1,6鍵,是合成C2C2,6型三天線和C2,4C2,6型四天線N糖鏈所必需的,細胞表面β1,6分支結(jié)構(gòu)的多少主要取決于GnT-V活性及表達的高低。大量研究表明腫瘤細胞侵襲很大程度上是由于細胞表面形成過量的N糖鏈β1,6分支結(jié)構(gòu)所致,過多的β1,6分支結(jié)構(gòu)導(dǎo)致生成多天線的N糖鏈
2、結(jié)構(gòu)改變了糖蛋白分子的生物學(xué)性狀,使腫瘤細胞粘附功能發(fā)生異常而易發(fā)生向周圍組織侵襲。本教研室以往的研究發(fā)現(xiàn)用反義核酸技術(shù)阻斷體外培養(yǎng)H7721人肝癌細胞的GnT-V基因表達,建立了GnT-V基因沉默細胞株GnT-V-AS/H7721,并且觀察到由于GnT-V基因沉默而引起的細胞表型改變,例如生長緩慢,對血清饑餓耐受下降,對凋亡誘導(dǎo)劑全反式維甲酸(ATRA)更加敏感等。為探討其機制用基因芯片技術(shù)(DNAmicroarray)對H7721細
3、胞和GnT-V-AS/H7721細胞基因轉(zhuǎn)錄水平表達譜進行比較,發(fā)現(xiàn)GnT-V-AS/HH7721細胞基因表達譜具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)的特征。ERstress是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白堆積到一定程度引起的一種真核細胞應(yīng)激現(xiàn)象,是近年來新發(fā)現(xiàn)的重要的凋亡起始機制之一,目前國外對ERstress的研究報導(dǎo)較多,國內(nèi)尚未見研究成果報導(dǎo)。本文以H7721細胞為材料從分子水平對GnT-V表達受阻后引起ERstress的現(xiàn)象進行了較為系統(tǒng)
4、的研究并探討其產(chǎn)生機制。 一.GnT-~-AS/H7721和H7721細胞基因轉(zhuǎn)錄水平表達情況的總體比較 本文運用基因芯片技術(shù)對GnT-V-AS/H7721和H7721細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的表達進行檢測和比較,結(jié)果表明GnT-V-AS/H772l細胞基因轉(zhuǎn)錄水平具有以下特點:(1)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊的伴侶蛋白如BIP、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酰肽酰異構(gòu)酶D和A以及一些熱休克蛋白表達上調(diào)為H7721細胞的3倍以上,其中BIP
5、更上調(diào)為8.21倍,(2)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的一些基因表達下降,如S5、S10、S14、S19、S21、L8、L10、L18、L27、L29、L37的表達僅為H7721細胞的0.11一O.45,(3)涉及泛肽和蛋白酶體的蛋白降解途徑的基因表達上調(diào),如泛肽水解酶,E2.泛肽結(jié)合酶,蛋白酶體亞基P40,P55,HC3,HC8,HC9表達為H7721細胞的2.6—6.6倍。通過復(fù)習(xí)文獻,表明這些現(xiàn)象符合近年來才發(fā)現(xiàn)的,普遍存在于真核細胞中的ERs
6、tress現(xiàn)象,因此推測GnT-V表達受阻可能是GnToV-AS/H7721細胞產(chǎn)生ERstress的起始原因。 二.GnT-V-AS/H7721和H7721細胞ERstress過程中的關(guān)鍵信息分子的檢測比較 為驗證GnT-V-AS/H7721細胞株存在ERstress現(xiàn)象,本文以GnT-V-AS/H7721細胞為實驗細胞,H7721細胞和二巰基蘇糖醇(DTT)處理的H7721細胞作為陰性和陽性對照,檢測ERstress
7、過程中的關(guān)鍵分子的表達。ERstress過程中的關(guān)鍵分子主要有BIP、XBPl和PERK等,其中伴侶蛋白BIP是ERstress信號傳導(dǎo)過程中最終上調(diào)的靶目標,其表達上調(diào)是公認的細胞發(fā)生ERstress標志。轉(zhuǎn)錄因子XBPl是哺乳動物細胞ERstress信號傳導(dǎo)過程中的中樞性調(diào)節(jié)分子,細胞發(fā)生ERstress時其mRNA發(fā)生特異性地剪接。PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的elF2ct蛋白激酶家族成員,細胞發(fā)生ERstress時特異性地發(fā)生活化,并通
8、過磷酸化翻譯起始因子elF20~而下調(diào)細胞蛋白合成水平。對這三種ERstress關(guān)鍵分子的檢測發(fā)現(xiàn):和陰性細胞相比較,實驗細胞中BIP的表達無論是蛋白水平還是轉(zhuǎn)錄水平都有明顯的上調(diào),但上調(diào)程度都要低于DTT處理的ERstress陽性細胞;XBP一1mRNA在實驗細胞中部分被剪接,在陽性細胞中XBP.1mRNA完全被剪接,而在陰性細胞中其以非剪接形態(tài)存在;此外和DTT處理的ERstress陽性細胞相似,實驗細胞中的PERK發(fā)生磷酸化,表明
9、ERstress過程中通過磷酸化elF2a抑制蛋白合成機制的活化,這和芯片所檢測到的GnT-V-AS/H7721細胞蛋白合成系統(tǒng)水平下調(diào)相一致。這些結(jié)果表明GnT-V-AS/H7721細胞中存在有ERstress現(xiàn)象,并且相對于DTT引起的ERstress程度較輕,可能是慢性的ERstress過程。因有研究表明非特異性的雙鏈RNA導(dǎo)入細胞可以激活胞內(nèi)蛋白激酶PKR而引起elF2a磷酸化,抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。GnT-V-AS/H772
10、1中含有整合的反義GnT-VcDNA,并且通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA與GnT-V的mRNA結(jié)合而起作用,反義GnT-VcDNA的整合也有可能作為非特異因素,為排除整合及雙鏈RNA原因?qū)е碌姆翘禺愐蛩馗蓴_,采用了反義寡聚核苷酸(asODN)技術(shù)阻斷H7721細胞中GnT-V的表達后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIP的表達同樣發(fā)生上調(diào),并且出現(xiàn)少量的剪接XBP一1mRNA,這表明GnT-V表達受阻可以特異性地引起胞內(nèi)ERstress。本教研室以往的研究發(fā)現(xiàn)GnT
11、-V-AS/H7721細胞相對于H7721細胞對凋亡誘導(dǎo)劑ATRA更加敏感,而ERstress是引起凋亡的重要因素之一,當(dāng)刺激信號過于劇烈,細胞產(chǎn)生的應(yīng)答仍不足以克服過強的刺激信號導(dǎo)致的細胞損傷時,位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿側(cè)的caspasel2能特異地被激活并參與ERstress引起的凋亡過程,本文發(fā)現(xiàn)ATRA處理的GnT-V-AS/H7721細胞中存在caspasel2活化,表明GnT-V-AS/H7721細胞對ATRA誘導(dǎo)的凋亡敏感性的增高和
12、胞內(nèi)的ERstress有關(guān)。 三.GnT-V-AS/H7721和H7721細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成及胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的比較 GnT-V表達受阻可以特異性地引起細胞發(fā)生ERstress,但GnT-V是高爾基體中的N糖鏈外鏈加工酶,并不參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈的合成及蛋白折疊過程。通過相關(guān)文獻和NCBI數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)直接參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成及蛋白折疊的酶和伴侶蛋白大多數(shù)是有N糖鏈的糖蛋白,GnT-V表達受阻后胞內(nèi)N糖鏈外鏈加工
13、方式的改變可能導(dǎo)致它們N糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,而正確的糖鏈結(jié)構(gòu)是糖蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能所必需的,因此考慮GnT-V表達受阻后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)N糖鏈合成酶和伴侶蛋白功能的異常是導(dǎo)致細胞ERstress的原因之一。為了研究GnT-V表達受阻對細胞N糖鏈合成的影響,本文以GnT-V-AS/H7721細胞為實驗細胞,H7721細胞和衣霉素(tunicamycinTM)處理H7721細胞作為對照,以3H_甘露糖摻入法研究三種細胞株糖蛋白N糖鏈合成的差異,結(jié)果發(fā)
14、現(xiàn)GnT-V-AS/H7721細胞和陽性對照相似,二者糖蛋白N糖鏈合成分別下降為H7721細胞的56%和26%,證明GnT-V表達受阻后可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中糖蛋白N糖鏈合成,表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N糖鏈合成酶功能發(fā)生下降,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈糖蛋白糖基化異常而引起細胞發(fā)生ERstress。為了檢測了GnT-V表達受阻后胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的改變,同樣以三種細胞株作為實驗對象,在去除細胞膜表面糖肽后,用HRP標汜的刀豆凝集素(ConA)和蔓陀羅凝集素(
15、DSA)分析胞內(nèi)糖蛋白的N糖鏈結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)GnT-V-AS/H7721細胞相對于H7721細胞對HRP-ConA染色增深,而對HRP-DSA染色變淺,表明GnT-V表達受阻后胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈β1,6-GlcNAc分支結(jié)構(gòu)含量減少,說明細胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)因GnT-V表達受阻而普遍發(fā)生改變,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成酶及伴侶蛋白的N糖鏈結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變,因此認為GnT-V表達受阻可能影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成酶和伴侶蛋白的N糖鏈結(jié)構(gòu),從而影響
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 人源N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(OGT)的原核表達及活性研究.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V表達受阻導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)細胞凋亡的研究.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控的影響.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖和小分子殼聚糖對小鼠肝細胞活力影響的研究.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V調(diào)控多藥耐藥小細胞肺癌的放射敏感性及機制.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V與前列腺癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系.pdf
- 下調(diào)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V增強人鼻咽癌細胞CNE-2放射敏感性.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ通過對α5β1整合素N-糖基化修飾調(diào)控滋養(yǎng)層細胞的侵襲.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達細胞株的構(gòu)建及其對神經(jīng)生長因子受體TrKA作用影響的研究.pdf
- N--乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶--V對小細胞肺癌細胞放射治療敏感性的影響.pdf
- 人肝癌細胞SMMC-7721過表達N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V對整合蛋白β1的N-糖鏈結(jié)構(gòu)、蛋白穩(wěn)定性及其功能的影響.pdf
- 下調(diào)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V對前列腺癌細胞放射治療和激素治療敏感性的影響.pdf
- 全反式維甲酸誘導(dǎo)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V表達受阻的肝癌細胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)生調(diào)亡的研究.pdf
- N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V通過VE-cadherin及β1整合素介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf
- 菜青蟲N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質(zhì)研究.pdf
- 棉鈴蟲N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力調(diào)控的研究.pdf
- 棉鈴蟲N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf
- 凡納濱對蝦N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力調(diào)控的研究.pdf
- 牛睪丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf
- N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶在腎細胞癌中表達及作用的研究.pdf
評論
0/150
提交評論