N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA作用影響的研究.pdf

1、N-糖鏈在細(xì)胞通訊、生長(zhǎng)、分化中起重要的作用，文獻(xiàn)報(bào)道有證據(jù)表明N-糖鏈在神經(jīng)發(fā)育中也起重要作用。目前糖組學(xué)(Glycomics)是后后基因組的研究重點(diǎn)。糖基轉(zhuǎn)移酶是廣泛存在的一大類酶，參與了聚糖、糖苷和復(fù)合糖類中糖部分的生物合成，具有高度的底物專一性。目前國(guó)際上關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶的研究較為初步，與其他類型的酶類相比，如參與代謝的酶類等，在酶的表達(dá)，受哪些因素調(diào)控等方面研究不夠透徹，而且其涉及的生物學(xué)效應(yīng)則更為廣泛，復(fù)雜。糖基轉(zhuǎn)移酶生物功能

2、的完全闡釋將揭示龐大的相關(guān)生物信息。 N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V，GnT-V/Mgat5，EC 2.4.1.155)作為重要的高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶，是糖蛋白N-糖鏈加工酶之一，具有決定N-糖鏈類型及復(fù)雜型糖鏈結(jié)構(gòu)的重要作用，催化GlcNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移至N-糖鏈核心α 1，6臂的α-甘露糖的反應(yīng)，形成N-糖鏈的β1，6分支結(jié)構(gòu)，能形成2、3、4天線的N-糖鏈產(chǎn)物，在

3、蛋白質(zhì)翻譯后修飾中起重要作用，而蛋白糖基化則是生物活性蛋白發(fā)揮其生物功能的必要條件之一，其中包括了具有重要功能的生長(zhǎng)因子的受體膜蛋白的修飾。N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V是重要的高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶，參與了糖蛋白N-糖鏈的合成，具有對(duì)糖蛋白翻譯后糖基化共翻譯修飾的重要功能。而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)糖基化共翻譯修飾過程能促使蛋白進(jìn)行正確折疊，同時(shí)蛋白質(zhì)糖基化共翻譯修飾也是真核細(xì)胞存活必需的。研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V的缺失能引起受體N-

4、糖鏈異常，糖基化異常能影響某些類型的細(xì)胞表面的受體功能，導(dǎo)致受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變。因此本文構(gòu)建GnT-V高表達(dá)細(xì)胞株研究糖蛋白糖鏈變化對(duì)受體功能的影響。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，作為重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能調(diào)節(jié)神經(jīng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化，通過高親和性的受體TrKA調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，不僅在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中，NGF受體TrkA表達(dá)升高與良好的預(yù)后相關(guān)，而且在神經(jīng)退行性病變中，如帕金森和阿爾茨海默氏癥(AD)，NGF也是治療

5、藥物研究的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶v高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA作用影響的研究熱點(diǎn)。NGF通過高親和性的受體引起軸突生長(zhǎng)細(xì)胞分化，而低親和性受體引起凋亡，微環(huán)境中NGF過低則不能引起軸突生長(zhǎng)。PC12細(xì)胞是大鼠腎嗜鎘瘤細(xì)胞，具有神經(jīng)細(xì)胞的特點(diǎn)，是研究NGF神經(jīng)軸突生長(zhǎng)良好的細(xì)胞模型，文獻(xiàn)報(bào)道，在正常狀態(tài)下50-100 ng/mL左右的NGF刺激幾天后能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)。因此選取該細(xì)胞作為研究細(xì)胞模型，觀察低濃

6、度NGF刺激下(降低4-8倍)GnT-V高表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的影響，而此低濃度下，NGF單獨(dú)不足以誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)。人神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(Trk A)含有4個(gè)潛在的N一糖鏈糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體Trk家族中高度保守，提示糖基化可能有重要的作用，另外還有9個(gè)不太保守的N-糖鏈糖基化位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的Trk A受體在保守和可變的N-糖鏈糖基化位點(diǎn)均有糖基化。這些位點(diǎn)的糖基化有兩種不同的功能，一是Trk A受體糖基化是阻止配體不依賴的激

7、活所必需的，去糖基化的TrkA受體核心蛋白在沒有配體激活時(shí)也是磷酸化的并且顯示組成性激酶活性作用于信號(hào)分子Shc和PLC-γ；二是Trk A受體糖基化是受體定位于細(xì)胞膜表面所必需的，只有在細(xì)胞膜表面的受體能引發(fā)Ras/Raf/MAP激酶通路。用激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)沒有糖基化的活性Trk受體陷入在細(xì)胞內(nèi)，不能定位細(xì)胞膜，而且沒有糖基化的活性Trk A受體不能激活Ras-MAP、MEK和ErK激酶通路，因此，沒有糖基化的Trk A受體核心蛋

8、白不能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元的分化。而且文獻(xiàn)報(bào)道去糖基化的Trk不能應(yīng)答其配體NGF，即衣霉素預(yù)處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的高表達(dá)Trk的PC12細(xì)胞后，抑制Trk糖基化，改變了Trk蛋白上GM1(ganglioside，神經(jīng)節(jié)苷脂，酸性糖鞘脂)結(jié)合位點(diǎn)，失去了與GM1形成復(fù)合物的能力。而且文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞膜N-糖鏈在神經(jīng)胚胎發(fā)育中有重要作用，值得注意的是GnT-V在神經(jīng)元細(xì)胞分化時(shí)期此酶的表達(dá)升高2-3倍，而GnT-V高表達(dá)引起的糖基化修飾的TrkA受

9、體核心蛋白對(duì)其功能的影響和對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)元的分化影響未見報(bào)道。 目前N-糖鏈與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系近年來備受關(guān)注，尤其是與GnT-V相關(guān)的β1，6分支結(jié)構(gòu)的研究。研究表明在惡性腫瘤中，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V活性增高，其催化產(chǎn)物β1，6分支也增加，腫瘤細(xì)胞表面β1，6分支存在能促進(jìn)其入侵基膜，β1，6分支已成為乳腺癌和結(jié)腸癌腫瘤惡化的標(biāo)志。細(xì)胞膜N-糖鏈在個(gè)體發(fā)育和腫瘤生成中有顯著變化提示N-糖鏈在細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移中

10、有重要作用。而GnT-V在神經(jīng)中的生物學(xué)作用還未見報(bào)道。在神經(jīng)發(fā)育中，復(fù)合型N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA作用影響的研究N-糖鏈尤其是神經(jīng)組織胚胎發(fā)育必須的。raguchi et al．報(bào)道指出腫瘤的侵襲與神經(jīng)軸突的應(yīng)答過程相似的概念，提示在腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用的糖基轉(zhuǎn)移酶GnT-V很可能在神經(jīng)中也起重要作用。神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)與腫瘤的遷移有很多相似之處，包括細(xì)胞骨架的變化和參與的信號(hào)調(diào)節(jié)通路。至今關(guān)

11、于GnT-V在神經(jīng)中的作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道，我們主要在此方面進(jìn)行闡釋。 綜上所述，本文選NGF為靶點(diǎn)，研究GnT-V轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后GnT-V高表達(dá)對(duì)NGF及受體誘導(dǎo)的軸突生長(zhǎng)通路的變化?？紤]到目前GnT-V在神經(jīng)中的生物學(xué)作用未見報(bào)道，因此本文首次在此方面進(jìn)行初步的探索研究，首先成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GnT-V的PC12細(xì)胞和mock組細(xì)胞，進(jìn)行了糖鏈和蛋白鑒定。研究NGF誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，GnT-V高表達(dá)，能修飾神

12、經(jīng)生長(zhǎng)因子受體，引起NGF低濃度下神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞軸突生長(zhǎng)明顯增強(qiáng)，提示GnT-V表達(dá)增加對(duì)神經(jīng)元分化具有調(diào)節(jié)作用。研究了GnT-V對(duì)PC12細(xì)胞的生物效應(yīng)，這種促進(jìn)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)的作用，是促分化作用。為了闡釋N-糖鏈的變化，將NGF受體TrKA免疫沉淀后，用凝集素PHA-L分析GnT-V酶作用產(chǎn)物β1，6分支結(jié)構(gòu)糖鏈。同時(shí)免疫沉淀TrKA受體，測(cè)定NGF受體的信號(hào)通路的激活，研究了轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GnT-V的細(xì)胞，mock組

13、細(xì)胞TrKA受體磷酸化隨時(shí)間的變化，TrKA受體用抗TrKA抗體免疫沉淀垂釣分析磷酸化水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GnT-V的細(xì)胞比mock組細(xì)胞磷酸化水平明顯升高。GnT-V轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞對(duì)NGF刺激軸突信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的敏感性增強(qiáng)?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)低濃度的NGF能引起PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的現(xiàn)象，進(jìn)一步研究GnT-V對(duì)TrKa受體作用的機(jī)理。 研究發(fā)現(xiàn)GnT-V高表達(dá)，免疫沉淀神經(jīng)生長(zhǎng)因子細(xì)胞膜受體TrKA糖鏈β 1，6分支結(jié)構(gòu)

14、增加，說明此酶GnT-V能直接糖基化修飾神經(jīng)生長(zhǎng)因子高親和性的受體TrKA，同時(shí)發(fā)現(xiàn)糖基化修飾的高親和性的受體TrKA的磷酸化增強(qiáng)。為進(jìn)一步解釋其機(jī)制，我們研究了不同時(shí)間點(diǎn)TrKA受體的內(nèi)吞，NGF-β孵育不同的時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GnT-V的細(xì)胞，mock組細(xì)胞NGF-β與受體TrKA結(jié)合內(nèi)吞的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GnT-V的PC12細(xì)胞與mock組相比，TrKA受體內(nèi)吞延遲，提示GnT-V高表達(dá)引起的N-糖鏈變化，使得NG

15、F受體TrKA內(nèi)吞延遲，進(jìn)而增強(qiáng)了受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，GnT-V高N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA作用影響的研究表達(dá)，修飾神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體，增強(qiáng)其功能，能引起低濃度NGF刺激下神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，GnT-V在神經(jīng)中可能通過修飾糖蛋白受體調(diào)節(jié)NGF誘導(dǎo)的信號(hào)通路，可能在與神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的神經(jīng)退行性病變中起作用。本文研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V糖基化修飾神經(jīng)

16、生長(zhǎng)因子受體TrKA，能調(diào)節(jié)TrKA受體的功能，激活TrKA受體介導(dǎo)的軸突生長(zhǎng)的信號(hào)通路。此論文的研究意義在于首次闡釋了N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的糖基化修飾作用對(duì)TrKA受體功能的影響，其研究結(jié)果為研究N-糖鏈在神經(jīng)中的作用提供了深層次的理論依據(jù)，拓展了對(duì)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V在神經(jīng)中作用的認(rèn)識(shí)。發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V具有促神經(jīng)分化作用，這種對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA的調(diào)節(jié)作用，可能與神經(jīng)生長(zhǎng)因子相