“新吉富”尼羅羅非魚N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質(zhì)研究.pdf

1、尼羅羅非魚是我國最重要的養(yǎng)殖魚類之一?！靶录弧蹦崃_羅非魚是在吉富羅非魚的基礎(chǔ)上研發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新品種，因具有卓越的生長優(yōu)勢被農(nóng)業(yè)部在全國范圍內(nèi)推廣。本論文對該魚N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）的性質(zhì)進(jìn)行了描述，并研究了外界環(huán)境條件對該酶性質(zhì)的影響。
　　經(jīng)40％～55%的硫酸銨分級沉淀、DEAE纖維素（DE-32）離子交換層析、Sephadex G-200凝膠過濾層析、DEAE-Sephadex（A-50

2、）層析柱從“新吉富”尼羅羅非魚精巢組織分離純化得到比活力為4100 U·mg-1的NAGase，經(jīng)電泳檢測為單一純。該酶的分子量為118.0 kD，水解底物對-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-NAG）的最適pH和最適溫度分別為pH5.7和55℃。37℃條件下該酶的pH穩(wěn)定范圍為3.3～8.1，當(dāng)溫度高于45℃時該酶開始失活。該酶水解底物 pNP-NAG遵循米氏方程，米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vm）分別為0.67 m

3、mol·L-1和23.26μmol·L-1?min-1。
　　金屬離子對“新吉富”尼羅羅非魚NAGase的活力影響實驗表明：Li+,Na+,K+,Mg2+和Ca2+等金屬離子對該酶活力基本沒有影響，重金屬離子對該酶的抑制強弱順序為Hg2+>Zn2+>Cu2+>Pb2+>Mn2+。Cu2+和Zn2+對該酶抑制的IC50分別為1.23和0.28 mmol·L-1，其抑制機理均為可逆抑制，其中Cu2+的抑制類型為非競爭型，Zn2+的抑制

4、類型為競爭型。這兩種金屬離子均能明顯影響該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，也都能改變酶的構(gòu)象從而影響到其內(nèi)源熒光的發(fā)射。
　　Hg2+對該酶呈強烈的不可逆抑制作用，IC50值僅為2.70μmol·L-1，而且Hg2+也能明顯縮短該酶的熱穩(wěn)定和pH穩(wěn)定范圍。進(jìn)一步通過底物反應(yīng)的動力學(xué)方法研究了Hg2+對該酶的抑制動力學(xué)，建立了相應(yīng)的動力學(xué)模型，經(jīng)測定Hg2+對自由酶和酶與底物復(fù)合物的微觀抑制速度常數(shù)k1和k'1分別為4.42×10-4 m

5、mol·L-1·s-1 and7.06×10-5 mmol·L-1·s-1。說明在Hg2+的抑制作用下，底物的存在對于該酶有明顯的保護(hù)作用。
　　本文還測定了羅非魚養(yǎng)殖過程中的一些常用藥物對該酶活力的影響，在測定濃度范圍內(nèi)內(nèi)服藥物對羅非魚NAGase的活力影響不大，鹽酸強力霉素卻對該酶有強烈的激活作用。而常用消毒劑強氯精和甲醛則對酶活力有明顯的抑制作用，其IC50值分別為0.25 mg·mL-1和3.2%。強氯精對該酶呈反競爭性可

6、逆抑制作用，而甲醛呈競爭性可逆抑制。兩種消毒劑均能明顯縮短該酶的熱穩(wěn)定和pH穩(wěn)定性。進(jìn)一步建立了該酶在這兩種消毒劑中的失活動力學(xué)模型，測定了其抑制速度常數(shù)。
　　用嗜水氣單胞菌322A腹腔感染健康“新吉富”尼羅羅非魚，測定其內(nèi)臟和血清NAGase比活力的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)感染后第1，3，5，9，13，17，21 d注射組的肝臟NAGase比活力明顯高于對照組，呈極顯著性差異（P<0.01）；腎臟NAGase比活力只在第1d和第3d極顯