全反式維甲酸誘導(dǎo)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V表達(dá)受阻的肝癌細(xì)胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)生調(diào)亡的研究.pdf

1、N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是分布在高爾基體中的一種重要的N-糖鏈加工酶,它以UDP-GlcNAc為供體,催化七糖二天線階段或八糖三天線階段的N-糖鏈形成三天線及四天線N-糖鏈。GnT-V與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān),其產(chǎn)物GlcNAcβ1,6Manα1,6結(jié)構(gòu)與多種癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)。本室研究發(fā)現(xiàn),GnT-V表達(dá)受阻增加了人肝癌SMMC7721細(xì)胞對(duì)全反式維

2、甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)的凋亡的敏感性,但機(jī)制尚不明確。此外,我們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生于GnT-V表達(dá)受阻的SMMC7721細(xì)胞。在本論文中,我們進(jìn)一步探討了ATRA誘導(dǎo)GnT-V表達(dá)受阻的SMMC7721細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制,并將其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激聯(lián)系起來。
　　在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)GnT-V反義cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SMMC7721細(xì)胞(GnT-V-AS/7721)中存在持續(xù)的慢性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

3、激。從本論文的第一部結(jié)果我們得出結(jié)論:ATRA通過加劇GnT-V-AS/7721細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在80μMATRA處理24小時(shí)的GnT-V-AS/7721細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子GRP78/Bip(glucose regulated protein 78/immunoglobulin chain binding protein)、CHOP(C/EBP homologus protein)及剪接后XBP1(X

4、box binding protein 1)的表達(dá)上調(diào),這些結(jié)果都說明ATRA加劇了本來存在于GnT-V-AS/7721細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。此外,ATRA處理的GnT-V-AS/7721細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)了caspase-12、-9和-3的剪切激活以及凋亡形態(tài)學(xué)變化,說明ATRA誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。以上的所有結(jié)果表明,ATRA通過加劇GnT-V-AS/7721細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這為我們提供了一個(gè)ATRA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的新機(jī)制。

5、進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),80μMATRA顯著抑制GnT-V-AS/7721細(xì)胞中GnT-V的表達(dá),這可能是ATRA加劇GnT-V-AS/7721細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制之一。
　　在論文的第二部分,我們?cè)?0μMATRA處理的GnT-V-AS/7721細(xì)胞中檢測(cè)到GRP78/Bip、CHOP、剪切后ATF6(activating transcription factor 6)蛋白及XBP1mRNA剪接產(chǎn)物的上調(diào),caspase-3、P

6、ARP[Poly(ADP-ribose)polymerase]也發(fā)生了剪切,這再次證明ATRA加劇了GnT-V-AS/7721細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)論。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)ATRA抑制了GnT-V-AS/7721細(xì)胞中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝酶CBS(cystathionine-β-synthase)和BHMT(betaine-homocysteine methyltransferase)的表達(dá)

7、,增加了細(xì)胞內(nèi)Hcy濃度,并降低了細(xì)胞內(nèi)GSH(glutathione)水平。為了觀察ATRA對(duì)細(xì)胞Hcy代謝的作用,我們用不同濃度的外源性Hcy處理細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA處理使GnT-V-AS/7721細(xì)胞中的Hcy濃度快速提升到一個(gè)很高的水平,這說明ATRA干擾了GnT-V-AS/7721細(xì)胞的Hcy代謝,造成了細(xì)胞內(nèi)Hcy堆積,因而增加了GnT-V-AS/7721細(xì)胞對(duì)外源性Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感性。同時(shí),我們也觀察到了G

8、RP78/Bip的顯著上調(diào)和XBP1mRNA的完全剪接。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在GnT-V-AS/7721細(xì)胞中,ATRA降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度,并阻礙了外源性Hcy誘導(dǎo)的GSH水平的提高。所有的結(jié)果表明,ATRA通過抑制Hcy代謝關(guān)鍵酶CBS和BHMT的表達(dá)提高細(xì)胞內(nèi)Hcy水平、降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度,從而加劇了GnT-V-AS/7721細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。值得一提的是,來源于正常肝組織的L02細(xì)胞對(duì)ATRA誘導(dǎo)的凋亡不敏感,A