下調(diào)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V對前列腺癌細(xì)胞放射治療和激素治療敏感性的影響.pdf

1、背景：
　　 前列腺癌是發(fā)生在男性中最常見的惡性腫瘤之一，并且隨著年齡的增長，其發(fā)病率越來越高。據(jù)報(bào)道，在20世紀(jì)80年代晚期以及90年代早期，美國新診斷的前列腺癌病例已超過肺癌作為男性中發(fā)病率最高的的腫瘤疾病。目前，前列腺癌的常見治療方法包括:根治性的手術(shù)、放療、內(nèi)分泌治療、化療等。放射治療作為傳統(tǒng)治療手段之一，廣泛應(yīng)用于不同分期的前列腺癌:早期前列腺癌的放射治療可以達(dá)到根治的目的，效果與根治性手術(shù)相似;局部晚期前列腺癌采取放

2、療結(jié)合內(nèi)分泌治療可提高存活率;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，姑息放療可以緩解局部癥狀，改善生活質(zhì)量。但臨床發(fā)現(xiàn)部分病人因放療抵抗導(dǎo)致放療后局部復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳。提高放射劑量可以減低腫瘤局部復(fù)發(fā)率，但是高劑量放療伴隨的副反應(yīng)，如腸道損傷、泌尿系統(tǒng)受損、性功能障礙等，卻嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。此外，內(nèi)分泌治療是晚期前列腺癌姑息治療的主要方法，雖然最初可獲得很高的有效率，但是相當(dāng)一部分病人在治療2-5年后病情進(jìn)展為激素抵抗性前列腺癌（HRPC），最終導(dǎo)致治療失

3、敗。長時(shí)間內(nèi)分泌治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生激素抵抗性的同時(shí)，對放射治療的耐受性同樣得到提高。因此，如何提高前列腺癌放射治療以及激素治療敏感性成為治療前列腺癌亟須解決的一個(gè)問題。
　　 生物體內(nèi)的大多數(shù)蛋白質(zhì)都是以糖蛋白的形式存在，而細(xì)胞表面糖蛋白寡糖鏈的結(jié)構(gòu)重塑對糖蛋白功能起重要的作用，已發(fā)現(xiàn)，這些寡糖鏈與細(xì)胞的分化、粘附、增殖、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而寡糖鏈的產(chǎn)生、結(jié)構(gòu)的改變是通過糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)。越來越多的證據(jù)表明，與糖基轉(zhuǎn)移酶

4、基因的變化可以直接影響腫瘤組織細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)變。糖基轉(zhuǎn)移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosarninyl-transferase-Ⅴ，GnT-Ⅴ)為糖蛋白N-糖鏈加工酶之一，主要分布在高爾基體中，其作用為決定N-糖鏈類型及復(fù)雜型糖鏈結(jié)構(gòu)，催化形成N-糖鏈的β-1，6分支。已發(fā)現(xiàn)GnT-Ⅴ對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移起重要作用。在許多惡性腫瘤組織中GnT-Ⅴ呈現(xiàn)高表達(dá)，提示不良的預(yù)后，如乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌。GnT-Ⅴ影響腫瘤

5、生物活性主要是通過改變β-1，6分支結(jié)構(gòu)從而上調(diào)EGFR信號通路，抑制蛋白酶體的降解，抑制E-cadherin/β-catenin復(fù)合物功能，最終促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
　　 盡管目前很多實(shí)驗(yàn)表明GnT-Ⅴ和多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，但是尚未有研究報(bào)導(dǎo)GnT-Ⅴ和前列腺癌之間的關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中，我們主要關(guān)注GnT-Ⅴ的表達(dá)是否影響前列腺癌的生物學(xué)行為，并進(jìn)一步探討其相關(guān)的內(nèi)在機(jī)制。
　　 目的：
　　 此

6、前，本課題組通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，比較干擾GnT-Ⅴ表達(dá)前后PC3細(xì)胞的增殖、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)下調(diào)GnT-Ⅴ表達(dá)可以增加激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3的放射敏感性，并進(jìn)一步研究其中可能涉及的相關(guān)機(jī)制。但是GnT-Ⅴ表達(dá)與激素依賴型前列腺癌細(xì)胞的放射敏感性是否存在同樣關(guān)聯(lián)卻未被研究。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用shRNA，構(gòu)建低表達(dá)GnT-Ⅴ的激素依賴型前列腺癌細(xì)胞株LncapGnT-Ⅴ/1079以及Lncap GnT-Ⅴ/1564。通過體內(nèi)及體外實(shí)

7、驗(yàn)對比正常的Lncap細(xì)胞和低表達(dá)GnT-Ⅴ的Lncap細(xì)胞的放射敏感性差異。另外，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步探討GnT-Ⅴ與前列腺癌細(xì)胞(Lncap，PC3)激素治療敏感性的關(guān)系。最后，通過細(xì)胞周期、凋亡蛋白家族、細(xì)胞信號通路方面研究GnT-Ⅴ影響前列腺癌細(xì)胞放射敏感性、激素敏感性的內(nèi)在機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定:由上海吉瑪公司完成。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)

8、及轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞株Lncap在37℃5％CO2條件下，培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640中，每周傳代1-2次。Lneap細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，參照invitrogen公司Lipofctamine2000TM產(chǎn)品說明書，用脂質(zhì)體Lipofctamine2000TM將質(zhì)粒導(dǎo)入Lncap細(xì)胞。用G418篩選陽性細(xì)胞克隆。
　　 3、干擾效果檢測
　　 (1) RT-PCR測定GnT-Ⅴ mRNA用Trizol提取

9、對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.GnT-Ⅴ上游引物為5'GAGCAGATCCTGGACCTCAG3'，下游引物為5'GCTGTCATGACTCCAGCGTA3'。使用GAPDH作為內(nèi)參，上游引物為5'AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3'，下游引物為5'AGGGGCCATCCACAGTCTTC3'。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30s，PCR:95℃5s，64℃34s，共40個(gè)循環(huán)，溶解曲線:95℃0s，

10、63℃60s，95℃0s.
　　 基于目的基因和看家基因?qū)崟r(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線得到Ct(C為Cycle，t為threshold)值，△CT代表目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)強(qiáng)度，公式為△CT=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。用Folds=2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組目的基因與對照組目的基因表達(dá)量的倍比關(guān)系，△△Ct=△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對照組。目的基因?yàn)镚nT-Ⅴ，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。
　　 (2) Western blot檢測Gn

11、T-Ⅴ蛋白表達(dá)提取總蛋白，測定總蛋白濃度，吸取40μg總蛋白，去離子水補(bǔ)至20μL，加入1/4體積5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取15μL上樣，經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶1000)、HRP

12、標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶2000)，室溫下?lián)u動1h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ的相對表達(dá)量。
　　 4、pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA干擾后對前列腺癌細(xì)胞株Lncap放射敏感性的影響（體外實(shí)驗(yàn)）
　　 (1)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測pGPU6/GFP/Neo

13、GnT-Ⅴ shRNA干擾后對Lncap細(xì)胞照射后克隆形成能力的影響取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，接種于6孔板，每孔200個(gè)細(xì)胞，24h后分別給予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy五個(gè)劑量點(diǎn)照射，然后置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)3周，待出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，加入0.1％結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)。通過克隆數(shù)計(jì)算出細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組，Lneap GnT-Ⅴ/1079組和Lncap Gn

14、T-Ⅴ/1564組，每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 (2) CCK-8法測定pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA干擾后對Lncap細(xì)胞單次6Gy照射后增殖能力的影響。
　　 取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，消化，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每組細(xì)胞6個(gè)復(fù)孔，鋪5塊板，置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)，24h后給予6 Gy照射。照射后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h、96h)分

15、別用CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力。測量各組的OD450nm值，繪制生長曲線，并計(jì)算干擾組的生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(IR)=（對照組OD450值—干擾組OD450值）/對照組OD450值×100％。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，LncapGnT-Ⅴ/NC組，Lncap GnT-Ⅴ/1079組和Lncap GnT-Ⅴ/1564組，每組重復(fù)例數(shù)為18。
　　 (3)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA干擾后對Ln

16、cap、PC3細(xì)胞單次6Gy照射后遷移能力的影響。
　　 取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，接種到6孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，置于37℃5％ CO2條件下靜止培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)100％時(shí)劃痕，并給予6 Gy照射。照射后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、48h)在同一位置拍照，并用Image-ProPlus6.0軟件測量劃痕距離，計(jì)算劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，LncapGnT-Ⅴ/NC組，Lncap GnT-Ⅴ/1079組

17、和Lncap GnT-Ⅴ/1564組;PC3組，PC3GnT-Ⅴ/NC組，PC3 GnT-Ⅴ/1079組和PC3 GnT-Ⅴ/1564組。每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 (4) Hoechst33258核染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA干擾后對Lncap細(xì)胞照射前后凋亡的影響。
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別給予0Gy及6Gy照射，72h后移去培養(yǎng)基，用1×PBS洗2次，4％多聚甲醛液室溫固

18、定20min，移去固定液，用PBS清洗2次，然后室溫孵育終濃度1ug/ml的Hoechst33258染色液5分鐘。孵育完畢后用PBS簡單清洗2次，吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片。然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別給予0Gy及6Gy照射，72h后消化細(xì)胞，1×P

19、BS洗3遍，取1×105個(gè)細(xì)胞，加入195μL Annexinv PE結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinv PE和1μL7-AAD輕輕混勻，室溫避光孵育10分鐘。1000rpm/min離心5分鐘，棄上清，加入200μL Annexinv PE結(jié)合液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)分為Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 (5)比色分析法測定Caspase-3活性取對數(shù)

20、生長期的細(xì)胞，分別給予6Gy照射，24、48、72h后，消化離心，PBS洗1次，離心，吸盡上清，按每200萬細(xì)胞加入100ul裂解液的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液冰上裂解細(xì)胞15min，期間渦旋振蕩34次，每次10s。4℃14000×g離心15min，收集上清測定蛋白濃度。取適量的待測樣品與Caspase-3底物DEVD-PNA以及檢測緩沖液混合，37℃孵育1-2h至顏色變化明顯，用96孔板在酶標(biāo)儀405nm比色。PBS作為陰性對照組。干擾

21、組樣品OD(405nm)值與對照組樣品OD(405nm)值的比值為Caspase-3活性的百分率。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 (6)流式細(xì)胞術(shù)檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA干擾對Lncap細(xì)胞照射后周期的影響。
　　 取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，分別給予0Gy，2Gy，6Gy，10Gy照射，24h后消化細(xì)胞，1

22、×PBS洗3遍，取1×106個(gè)細(xì)胞，加入2ml于-20℃預(yù)冷的70％乙醇，4℃冰箱過夜。染色前用PBS離心沉淀去除固定液，冷PBS洗2次。加入100μLRNA酶RNaseA，37℃水后冰上終止RNaseA作用。每ml細(xì)胞懸液加入50μg/ml碘化丙啶PI染色液I00μL混勻，37℃避光15min。流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)分為Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 (7) West

23、ern blot檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA對Lncap細(xì)胞照射前后凋亡相關(guān)蛋白的改變。
　　 提取總蛋白，測定蛋白濃度，吸取40μg總蛋白，去離子水補(bǔ)至20μL，加入5μL5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取15μL上樣，經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人bax蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bcl-2

24、蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bcl-x1蛋白單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶1000)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶2000)，室溫下?lián)u動1h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，用bax/GAPDH代表bax的相對表達(dá)量，bcl-

25、2/GAPDH代表bcl-2的相對表達(dá)量，bcl-x1/GAPDH代表bcl-x1的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和LncapGnT-Ⅴ/1079組，每組重復(fù)例數(shù)為3。
　　 (8)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)測定pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA對Lncap、PC3細(xì)胞照射前后NF-kB信號通路的改變。
　　 取對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，鋪24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，置于

26、37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)。24h后行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(0.9ug的PNF-kB-LUC+0.05ug PRL-CMV)。轉(zhuǎn)染后24h給予6Gy照射，照射后0h、6h行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組螢火蟲熒光值F/海腎熒光值。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和LncapGnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 5、pGPU6/GFP/Neo

27、GnT-ⅤshRNA干擾后對前列腺癌細(xì)胞株Lncap放射敏感性的影響（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）
　　 (1)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)5周齡BALB/c裸鼠，雄性。每組各16只。細(xì)胞重懸于PBS，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/ml，按100lμL/只進(jìn)行臀部皮下注射。當(dāng)腫瘤體積達(dá)200-300mm3，給予2Gy照射連續(xù)5天。照射后每隔3d測量腫瘤體積，按V=0.5ab2(V代表腫瘤體積，a為長徑，b為短徑)繪制生長曲線，并記錄裸鼠生存時(shí)間。
　　 (2

28、)生存分析每組取10只裸鼠，記錄每只裸鼠的生存天數(shù)。
　　 (3)免疫組化石蠟切片脫蠟和水化后，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。切片加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育5分鐘，加動物非免疫血清，室溫下孵育10分鐘。除去血清，每張切片加一滴一抗(GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1∶200)、Bax單克隆抗體(1∶200)、Bcl-2多克隆抗體(1∶200)、Bcl-xl多克隆抗體(1∶200))，4℃冰箱過夜，PBS液沖洗。之后切片滴加生物素

29、標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30分鐘，PBS液沖洗。每張切片加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育10分鐘。沖洗后滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，瀝干1分鐘后流水沖洗，鹽酸酒精分化，流水沖洗，烤干，封片。
　　 6、pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA干擾后對前列腺癌細(xì)胞株Lncap、PC3激素治療敏感性的影響。
　　 (1) CCK-8法測定pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ

30、shRNA干擾后對Lncap、PC3細(xì)胞氟他胺作用后增殖能力的影響。
　　 取各組對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，消化，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每組細(xì)胞6個(gè)復(fù)孔，置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)，24h后更換含不同濃度氟他胺(0umo1/l、10umol/l、20umol/l、50umol/l、100umol/l)的完全培養(yǎng)基。72h后分別用CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力。測量各組的OD450nm值，

31、計(jì)算干擾組的生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率（IR）=（對照組OD450值—干擾組OD450值）/對照組OD450值×100％。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復(fù)例數(shù)為18。
　　 (2) Western blot檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA對Lncap、PC3細(xì)胞氟他胺作用前后

32、凋亡相關(guān)蛋白的改變。
　　 提取總蛋白，測定蛋白濃度，吸取40μg總蛋白，用PBS補(bǔ)至20μL，加入5μL5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取15μL上樣，經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人bcl-2蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bcl-xl蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bax蛋白單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH

33、蛋白單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶1000)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶2000)，室溫下?lián)u動1h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，用bax/GAPDH代表bax的相對表達(dá)量，bcl-2/GAPDH代表bcl-2的相對表達(dá)量，bcl-xl/GAPDH代表bcl-xl的相對表達(dá)量

34、。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復(fù)例數(shù)為3。
　　 (3)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)測定pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA對Lncap、PC3細(xì)胞氟他胺作用前后WNT信號通路的改變。
　　 取對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，鋪24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，置于37℃5％CO2條件

35、下靜止培養(yǎng)。24h后行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(0.9ug的PTCF4-LUC+0.05ug PRL-CMV)。轉(zhuǎn)染后24h更換含10umol/l的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加藥后0h、72h行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組螢火蟲熒光值F/海腎熒光值。實(shí)驗(yàn)分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復(fù)例數(shù)為9。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)

36、SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)。所給數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)注差。以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Westem-Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果多組比較采用方差分析，多重比較采用LSD法。平板克隆實(shí)驗(yàn)、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)多組比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，組內(nèi)多重比較采用LSD法，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Caspase-3活性檢測實(shí)驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。其中Western-Blot、

37、實(shí)時(shí)定量RT-PCR則取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，將實(shí)驗(yàn)組換算成對照組的相對百分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。參數(shù)比較均先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差不齊，用基于方差不齊的近似F檢驗(yàn)Welch法。皮下成瘤試驗(yàn)瘤體體積采用重復(fù)測量的方差分析，組內(nèi)比較采用one-wayANOVA分析，組內(nèi)的多重比較采用LSD法，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);三組生存時(shí)間的比較采用Kaplan-Merer法分析。
　　 結(jié)果
　　 1、重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGP

38、U6/GFP/Neo中含有編碼GFP的基因，故轉(zhuǎn)染細(xì)胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光。另外，質(zhì)粒中的Neo基因同時(shí)賦予轉(zhuǎn)染細(xì)胞G418抗性。因此，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將含有GnT-Ⅴ shRNA的質(zhì)粒導(dǎo)入Lncap細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察，所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞均發(fā)熒光，并且可在含G418培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代，說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功。
　　 2、干擾效果檢測實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出Lncap GnT-Ⅴ/1079和L

39、ncap GnT-Ⅴ/1564組細(xì)胞GnT-Ⅴ基因的mRNA表達(dá)較Lncap、Lncap GnT-Ⅴ/NC組明顯降低，表明轉(zhuǎn)染GnT-Ⅴ shRNA載體能抑制目的基因mRNA表達(dá);Western blot結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染GnT-ⅤshRNA載體能抑制GnT-Ⅴ蛋白表達(dá)。Image-Pro Plus6.0軟件分析GnT-Ⅴ基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平，按照公式進(jìn)行計(jì)算后顯示Lncap GnT-Ⅴ/1079、Lncap GnT-Ⅴ/1564組

40、mRNA水平的抑制率分別為74％和64.3％，蛋白水平的抑制率分別為68.7％和54.7％，與Lncap、Lncap GnT-Ⅴ/NC組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 3、GnT-ⅤshRNA對細(xì)胞放療前后增殖、遷移能力的影響
　　 (1)、以細(xì)胞在不同照射劑量(0Gy2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)的克隆形成率繪制細(xì)胞生存率曲線，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/1564組的生存率

41、較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組低，說明下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可進(jìn)一步抑制Lncap細(xì)胞放療后的克隆形成能力。
　　 (2)、以細(xì)胞在6Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h、96h)繪制細(xì)胞生長曲線，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/1564組的生長抑制率較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組高，可見下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可增強(qiáng)放療對Lncap細(xì)胞的生長增殖抑制作用。

42、>　　 由于在既往實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)組尚未研究GnT-Ⅴ的表達(dá)與PC3細(xì)胞放療后遷移能力之間的關(guān)系，因此補(bǔ)充劃痕實(shí)驗(yàn)，分析GnT-Ⅴ shRNA對Lncap、PC3細(xì)胞照射后遷移能力的改變。
　　 (3)、以細(xì)胞在6Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、48h)測量劃痕距離，Lncap GnT-Ⅴ/1564及Lncap GnT-Ⅴ/1079的劃痕愈合率較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組低;PC3 GnT-Ⅴ/15

43、64及PC3 GnT-Ⅴ/1079的劃痕愈合率較PC3組及PC3GnT-Ⅴ/NC組低，可見下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可進(jìn)一步抑制PCa細(xì)胞放療后的遷移能力。
　　 由于在檢測細(xì)胞增殖、遷移能力實(shí)驗(yàn)上，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/1564均較對照組Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC低，而Lncap GnT-Ⅴ/1079與LncapGnT-Ⅴ/1564細(xì)胞之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是Lncap GnT-

44、Ⅴ/1079細(xì)胞GnT-Ⅴ干擾效率更高，因此選擇Lncap GnT-Ⅴ/1079細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4、GnT-Ⅴ shRNA對細(xì)胞放療前后凋亡的影響Hoechst33258核染色及流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ-PE/7-AAD法測定放射前后各組Lncap細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示，放射治療前Lncap GnT-Ⅴ/NC組、Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞的凋亡率分別為:(1.30±0.26)％、(3.15±0.56)％;放

45、射治療后Lncap GnT-Ⅴ/NC組、Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞的凋亡率分別為:(9.66+0.73)％、(12.38+0.82)％。說明下調(diào)GnT-Ⅴ可提高Lncap細(xì)胞放療后的凋亡率。
　　 5、GnT-Ⅴ shRNA增加細(xì)胞放療敏感性可能涉及的機(jī)制
　　 (1)、以細(xì)胞在6Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h)檢測各組細(xì)胞的caspase-3活性，Lncap GnT-Ⅴ/1079組均高于

46、Lncap、Lncap GnT-Ⅴ/NC組，可見下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可通過增加caspase-3活性從而提高Lncap細(xì)胞的放射敏感性。
　　 (2)、以細(xì)胞在不同劑量(0Gy,2Gy,6Gy,10Gy)照射后檢測各組細(xì)胞周期比例，可見Lncap GnT-Ⅴ/NC組細(xì)胞照射后出現(xiàn)明顯G2/M阻止;Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞照射后G2/M期阻止不明顯，推測下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)通過打破Lncap細(xì)胞放療誘導(dǎo)的G2/M期阻

47、止從而增加放療敏感性。
　　 (3)、以細(xì)胞在6Gy照射前后檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在放射治療前后Bax表達(dá)量均高于Lncap及LncapGnT-Ⅴ/NC組;Bcl-2表達(dá)量均低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-x1三組無明顯差別?？梢娤抡{(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)通過增加Bax/Bcl-2比例增加Lncap細(xì)胞的放療敏感性。
　　 (4)、以細(xì)胞在6Gy照

48、射前后檢測NF-kB信號通路表達(dá)水平，Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在放射治療前螢火蟲熒光值F/海腎熒光值低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組，放射治療后進(jìn)一步增加與對照組的差距;PC3 GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在放射治療后螢火蟲熒光值F/海腎熒光值低于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組，放射治療后進(jìn)一步增加與對照組的差距?？梢娤抡{(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可通過阻斷NF-kB信號通路從而增強(qiáng)PCa細(xì)胞的放療敏感性。
　

49、　 6、GnT-ⅤshRNA對裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)的影響
　　 (1)、X線照射后，Lncap GnT-Ⅴ/1079腫瘤體積增長較Lncap和Lncap GnT-Ⅴ/NC速度慢，差異顯著。Lncap GnT-Ⅴ/1079組裸鼠生存期較Lncap和LncapGnT-Ⅴ/NC長。
　　 (2)、免疫組化實(shí)驗(yàn)示:Bcl-2表達(dá)于胞漿及細(xì)胞核中，Lncap GnT-Ⅴ/1079表達(dá)量低于Lncap GnT-Ⅴ/NC; Bax表達(dá)于

50、胞漿，Lncap GnT-Ⅴ/1079表達(dá)量高于Lncap GnT-Ⅴ/NC; Bcl-x1表達(dá)于胞漿，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/NC表達(dá)量無明顯差異。
　　 (3)、從各組腫瘤組織中提取蛋白，行western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組相比，Lncap GnT-Ⅴ/1079組表達(dá)Bax較高、Bcl-2較低、Bcl-xl無明顯差異。

51、
　　 此前，本實(shí)驗(yàn)研究組主要關(guān)注GnT-Ⅴ與前列腺癌放射敏感性之間的關(guān)系，但是其與前列腺癌激素敏感性的關(guān)系尚未研究，因此，本實(shí)驗(yàn)探討GnT-Ⅴ的表達(dá)能否影響PCa細(xì)胞(Lncap，PC3)激素敏感性，并從凋亡蛋白表達(dá)、細(xì)胞信號通路方面討論其中內(nèi)在機(jī)制。
　　 7、GnT-Ⅴ shRNA對細(xì)胞激素治療敏感性的影響以細(xì)胞在不同濃度氟他胺(0umol/l、10umol/l、20umol/l、50umol/l、100umol/

52、l)作用后72h檢測各組細(xì)胞活力，計(jì)算生長抑制率，Lncap GnT-Ⅴ/1079的生長抑制率均較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組高，PC3 GnT-Ⅴ/1079的生長抑制率均較PC3組及PC3 GnT-Ⅴ/NC組高，可見下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可增加PCa的激素敏感性。
　　 8、GnT-Ⅴ shRNA增加細(xì)胞激素敏感性可能涉及的機(jī)制
　　 (1)、以細(xì)胞在10umol/l氟他胺作用24h后提取蛋白，檢測凋亡相

53、關(guān)蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在藥物作用前后Bax表達(dá)量均高于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-2表達(dá)量均低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-xl三組無明顯差別;PC3 GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在藥物作用前后Bax表達(dá)量均高于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-2表達(dá)量均低于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-xl三組無明顯差別;可見下調(diào)GnT

54、-Ⅴ的表達(dá)通過增加Bax/Bcl-2比例增加PCa細(xì)胞的激素敏感性。
　　 (2)、以細(xì)胞在10umol/l氟他胺作用前后檢測WNT信號通路表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lncap GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在氟他胺作用前后螢火蟲熒光值F/海腎熒光值均低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;PC3 GnT-Ⅴ/1079組細(xì)胞在氟他胺作用前后螢火蟲熒光值F/海腎熒光值均低于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組，可見下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可

55、通過阻斷WNT信號通路從而增加PCa細(xì)胞的激素敏感性。
　　 結(jié)論
　　 1、靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒可以顯著下調(diào)GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 2、下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)可以提高PCa細(xì)胞的體外、體內(nèi)放射敏感性。
　　 3、下調(diào)GnT-Ⅴ的表達(dá)提高PCa細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制可能是通過抑制NF-kB信號通路表達(dá)，從而解除放療誘導(dǎo)的G2/M期阻止以及影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。