谷胱甘肽存在下鉑類配合物與DNA作用機(jī)制研究.pdf

1、自20世紀(jì)70年代Rosenberg發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗細(xì)胞增殖活性以來，順鉑一直是腫瘤化學(xué)療法中最為有效的藥物之一。然而順鉑存在著水溶性差，毒副作用大和耐藥性等缺陷，在一定程度上限制了其應(yīng)用，為了克服這些不足，人們設(shè)計開發(fā)了許多種類的鉑類配合物，包括修飾其離去基團(tuán)的卡鉑類配合物，修飾載體配體的奧沙利鉑類配合物，以及在軸向位置上進(jìn)行修飾的鉑(Ⅳ）類配合物?；趯︺K類配合物作用機(jī)理和耐藥機(jī)制的不斷深入研究，鉑類藥物被發(fā)現(xiàn)在進(jìn)入體內(nèi)之后，會與許多

2、含硫生物分子發(fā)生相互作用，這些相互作用會影響鉑藥的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、藥效和排出等多方面生理過程。還原性谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的含硫生物分子，在機(jī)體防御體系中起著重要作用，能與外源物質(zhì)或重金屬離子結(jié)合形成復(fù)合物，從而起到解毒的作用。由于谷胱甘肽含有巰基、氨基、羧酸、酰胺等多種配位基團(tuán)，是研究生物分子與鉑類配合物之間相互作用較理想的模型。研究DNA和含硫生物分子與鉑配合物的相互作用對于探索鉑類化合物在體內(nèi)生理功能和毒性機(jī)理有重要意義。
　

3、　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以奧沙利鉑為研究對象，使用液質(zhì)聯(lián)用方法，分別檢測了奧沙利鉑與鳥苷酸、谷胱甘肽的結(jié)合產(chǎn)物，共確認(rèn)了9個反應(yīng)產(chǎn)物。其中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ為首次報道的反應(yīng)產(chǎn)物，產(chǎn)物Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ為反應(yīng)中間體，對產(chǎn)物Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ進(jìn)行了定性定量測定。通過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑較順鉑而言，其1，2-環(huán)己二胺配體基團(tuán)是穩(wěn)定的，沒有發(fā)生如順鉑的氨基配體被取代的現(xiàn)象。奧沙利鉑與DNA的結(jié)合產(chǎn)物以雙功能加合為主，其單功能加合產(chǎn)物為反應(yīng)中間體

4、。奧沙利鉑與DNA的結(jié)合產(chǎn)物并不穩(wěn)定，能夠繼續(xù)被親核試劑谷胱甘肽所取代。谷胱甘肽能夠與奧沙利鉑形成雙結(jié)合產(chǎn)物Ⅶ，該產(chǎn)物能夠向橋環(huán)產(chǎn)物Ⅴ轉(zhuǎn)化。研究表明谷胱甘肽參與奧沙利鉑與鳥苷酸的反應(yīng)主要通過兩種方式進(jìn)行，一是與鳥苷酸競爭消耗活性鉑配合物，二是取代結(jié)合在鉑單元上的鳥苷酸分子。⑵選擇課題組前期研究的具有較好抗腫瘤活性的橋環(huán)鉑(Ⅱ）配合物2a為研究對象，利用HPLC-MS方法，研究了該位阻型化合物與DNA和谷胱甘肽的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明橋環(huán)

5、二胺配體雖然不能夠阻止谷胱甘肽與鳥苷酸共結(jié)合到鉑單元上，但能夠明顯抑制谷胱甘肽對鳥苷酸的取代反應(yīng)。由于橋環(huán)二胺的位阻效應(yīng)，谷胱甘肽對鳥苷酸的取代活性被降低。位阻基團(tuán)的引入不僅降低了鉑配合物與谷胱甘肽的反應(yīng)活性，而且增加了鉑與DNA加合物的穩(wěn)定性。⑶設(shè)計和合成了以(1R，2R)-B1-甲氧基芐基-1，2-環(huán)己二胺為配體的15個具有空間位阻的鉑(Ⅱ)配合物。采用MTT方法對合成的鉑(Ⅱ)類配合物進(jìn)行了初步體外細(xì)胞毒活性研究，當(dāng)離去基團(tuán)為氯離

6、子時，配合物1-3的細(xì)胞毒活性優(yōu)于或相當(dāng)于順鉑和奧沙利鉑。利用人胃癌細(xì)胞SGC7901和順鉑耐藥細(xì)胞SGC7901/CCDP考察時發(fā)現(xiàn)，配合物1-3的耐藥指數(shù)在0.59-0.91范圍內(nèi)，具有克服順鉑耐藥的潛力。鑒于配合物1在體外細(xì)胞毒活性研究中表現(xiàn)出的優(yōu)勢，對該配合物進(jìn)行了其它生物實(shí)驗的研究，包括:凝膠電泳、細(xì)胞攝取、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和Western blot測試。研究表明配合物1在與DNA的作用強(qiáng)度以及細(xì)胞攝取量上要明顯弱于其先導(dǎo)化

7、合物——奧沙利鉑。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路與其先導(dǎo)化合物一致，是內(nèi)源性線粒體通路，但誘導(dǎo)凋亡能力要弱于順鉑，略強(qiáng)于奧沙利鉑。⑷利用HPLC-MS技術(shù)，研究了配合物1與鳥苷酸的相互作用，結(jié)果表明配合物1以單功能加合物為主要產(chǎn)物，與位阻型配合物2a以及其母體化合物奧沙利鉑等雙功能配合物有顯著的差別，解釋了凝膠電泳實(shí)驗中配合物1與DNA的作用強(qiáng)度最弱的情況。研究了在含硫生物分子存在下，配合物1與鳥苷酸的相互作用。實(shí)驗數(shù)據(jù)表明配合物1與DNA的結(jié)合十

8、分穩(wěn)定，而在相同情況下，奧沙利鉑存在產(chǎn)物之間的相互轉(zhuǎn)換，從而彌補(bǔ)了配合物1細(xì)胞攝取低的缺陷，使其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。⑸針對鉑(Ⅳ)類配合物的研究主要包括:配合物結(jié)構(gòu)對其水溶液的穩(wěn)定性、與DNA的相互作用和氧化還原反應(yīng)的影響。在水溶液的穩(wěn)定性方面，平面結(jié)構(gòu)的載體基團(tuán)對鉑(Ⅳ)配合物影響較大，氨基為配體的化合物比反式1，2-環(huán)己二胺的穩(wěn)定性弱;離去基團(tuán)對其水溶液穩(wěn)定性影響不大;軸向配體對其水溶液的穩(wěn)定性影響最大。在與生物分子的相互作用方面