毒品原植物大麻DNA檢測技術(shù)的研究.pdf

1、大麻是一種古老的栽培植物，是許多國家重要的經(jīng)濟(jì)作物。但因其含有毒性成分一四氫大麻酚(THC)和大麻二醇(CBD)，已被聯(lián)合國禁毒公約列為與海洛因、可卡因并列的三大毒品之一。近年來，毒品問題日益嚴(yán)重。無論是在中國，還是在世界范圍內(nèi)，其都對人類的生存和社會發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。因此，禁毒是擺在世界人民面前的一項(xiàng)迫切任務(wù)，而這又是一項(xiàng)極其復(fù)雜的系統(tǒng)工程，需要多部門、多領(lǐng)域、多學(xué)科的相互配合。這其中非常重要的一種手段就是應(yīng)用現(xiàn)代的科學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)對

2、繳獲的毒品進(jìn)行定性和定量，以便確定其來源，從而使根除毒源成為可能。目前主要是通過傳統(tǒng)的化學(xué)方法和生物學(xué)手段來分析大麻中的毒性成份從而對其進(jìn)行定性和定量并推斷毒源。這些方法在檢測中常常需要大量的大麻樣品，而且必須是新鮮的，因?yàn)樗臍浯舐榉?THC)在陳舊標(biāo)本中很容易被氧化，使檢驗(yàn)具有一定的局限性。 在大麻毒品的案件中，常見的檢材是不同條件下放置的干葉或發(fā)霉、腐敗的陳舊標(biāo)本，還有一些含脂類物質(zhì)較多的大麻樹脂產(chǎn)品。這些檢材在獲得時(shí)多半是

3、被曬干、切碎的大麻制品，肉眼觀察很難與茶葉等外觀相近的植物進(jìn)行分辨。在大麻犯罪案件中還經(jīng)常繳獲到成批未加工的大麻植物，可能來自于同一產(chǎn)地的大麻品種，或來自于不同產(chǎn)地的不同大麻品種，如能鑒別出這些大麻的品種，則能推斷所繳大麻的毒源地，為鏟除毒品源頭提供重要幫助。 本研究旨在針對法庭科學(xué)中常見的毒品原植物一大麻標(biāo)本的特點(diǎn)，初步建立適用于實(shí)際辦案的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、方便的大麻植物基因組DNA的提取及擴(kuò)增檢測方法，通過DNA分析技術(shù)檢測

4、大麻的遺傳多態(tài)性，并能有效的鑒別、鑒定毒品原植物一大麻。目前利用DNA分析技術(shù)來檢測毒品原植物的特性并鑒定不同產(chǎn)地的毒品原植物正逐漸成為禁毒工作中一項(xiàng)重要內(nèi)容，為推斷毒品的來源開辟了一條新的技術(shù)途徑。這個(gè)新技術(shù)的開展將會推動法庭科學(xué)對毒物毒品的深入研究，對于禁止毒品流行、禁種禁吸以及對于基層辦案和對毒品的檢驗(yàn)工作都具有一定的實(shí)際意義和使用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)所開展的工作是國家十一五支撐計(jì)劃項(xiàng)目的前期內(nèi)容，其為后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)，

5、填補(bǔ)了國內(nèi)毒品原植物DNA檢驗(yàn)在法庭科學(xué)應(yīng)用的空白。 1 新鮮大麻基因組DNA提取方法的建立及大麻特異遺傳片段的篩選 目的：用改良的SDS方法對新鮮大麻嫩葉進(jìn)行基因組DNA提取及檢測的方法，并篩選出對大麻特異的遺傳片段，建立一種穩(wěn)定、靈敏、實(shí)用的毒品原植物大麻DNA檢驗(yàn)的方法，為大麻涉毒案件的來源推斷奠定基礎(chǔ)。 方法：對傳統(tǒng)的SDS方法略有改動，通過改變提取緩沖液中β-巰基乙醇的終濃度提取了5個(gè)品種共20份(雌、

6、雄)新鮮大麻標(biāo)本的基因組DNA。在提取過程中，先將標(biāo)本用液氮速凍后粉碎，再經(jīng)研磨釋放DNA然后用SDS裂解緩沖液抽提。提取到的大麻基因組DNA用核酸蛋白定量儀進(jìn)行定量，用所篩選的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測大麻的基因組DNA。同時(shí)對大麻特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序。 結(jié)果：使用改良SDS方法提取新鮮大麻植物標(biāo)本DNA，獲得了清晰的凝膠電泳圖譜，從候選的5對植物通用引物中篩選出一對大麻的特異引物，經(jīng)測序后確定為約190

7、bp大小的片段。應(yīng)用該對引物擴(kuò)增非大麻類植物參照標(biāo)本，未檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。 結(jié)論：選用改良SDS法提取新鮮大麻植物標(biāo)本DNA，可以獲得高質(zhì)量的大麻基因組DNA，足以用于進(jìn)一步檢測所需。用所篩選的大麻特異遺傳片段可以鑒別大麻與其它植物的種屬，對毒品案件的鑒定提供了一種實(shí)用、有效的方法。 2 特殊大麻標(biāo)本DNA提取方法的建立及不同方法的比較 目的：初步建立室溫保存10年以上大麻干葉子及大麻樹脂的基因組DNA提取方法。建

8、立穩(wěn)定的從降解嚴(yán)重陳舊的大麻標(biāo)本獲得高質(zhì)量DNA的提取方法。 方法：用SDS法、CTAB法、改良高鹽低pH法、堿裂解法及磁珠純化的方法對特殊陳舊大麻檢材進(jìn)行基因組DNA提取，通過比較以確定最佳的提取方法。即高鹽低pH方法，提取了新鮮大麻標(biāo)本和陳舊大麻(樹脂)標(biāo)本的DNA，模板DNA經(jīng)定量后選擇最適濃度為5～10ng/μl，應(yīng)用大麻葉綠體trnL intron的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。 結(jié)果：

9、在SDS法、CTAB法、改良高鹽低pH法、堿裂解法這4種提取大麻基因組DNA方法中，尤以改良高鹽低pH方法最佳，得到了純度較高、片段較完整的大麻基因組DNA。經(jīng)檢測獲得了 10年以上大麻干葉及大麻樹脂的清晰凝膠電泳圖譜，其中成功提取了1份22年陳舊大麻樹脂標(biāo)本的DNA。 結(jié)論：該方法操作簡便、實(shí)用，對于陳舊、降解的特殊大麻標(biāo)本及大麻樹脂產(chǎn)品DNA的提取效果尤佳。同時(shí)該方法可用于檢測大麻植株來源，對于法庭科學(xué)的研究和實(shí)際檢案均具有

10、重要的意義。 3 特異的大麻性別位點(diǎn)研究 目的：設(shè)計(jì)對大麻雄性植株特異的引物，以鑒別具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大麻雄性植株，尤其在大麻幼苗期能夠區(qū)分開具有藥用價(jià)值和濫用潛力的大麻雌性植株和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雄性植株，以期在毒品案件中能從DNA水平上識別大麻雌、雄樣本。 方法：用SDS法、改良高鹽低pH法和磁珠法提取新鮮和陳舊大麻雌、雄標(biāo)本及大麻樹脂標(biāo)本的基因組DNA，使用“Primer Premier 5.0”軟件設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增

11、，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。 結(jié)果：自行設(shè)計(jì)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約300～320bp大小的產(chǎn)物片斷，在電泳檢測時(shí)，只有Ym21、Ym23、Ym26、Ym71四種雄性大麻標(biāo)本全部出現(xiàn)了清晰的譜帶，而同樣條件下擴(kuò)增的六種陳舊雌性大麻標(biāo)本均未檢測到譜帶。 結(jié)論：初步認(rèn)為這對引物的擴(kuò)增片斷長度在大麻植株雌、雄性別間存在差異。但尚需分析更多的標(biāo)本，并進(jìn)行序列測定，進(jìn)一步明確引物的種屬特異性及性別特異性。 4 大麻ST

12、R位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性研究 目的：研究CS1和ANUCS305 STR位點(diǎn)在中國不同地區(qū)大麻中的遺傳多態(tài)性，并探討其在法庭科學(xué)中的應(yīng)用。建立穩(wěn)定、靈敏、實(shí)用的大麻STR位點(diǎn)的分析檢測方法，對不同大麻品種的個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，檢驗(yàn)結(jié)果能夠有效的鑒別、鑒定毒品原植物大麻。通過研究初步嘗試?yán)肧TR分析技術(shù)推斷涉毒案件巾所繳大麻的來源地。 方法：以5-FAM 熒光染料標(biāo)記設(shè)計(jì)、改進(jìn)、篩選的CS1和ANUCS305兩個(gè)STR位點(diǎn)

13、，對云南大麻四個(gè)品種62株個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過ABl310/3100毛細(xì)管電泳基因型分析儀，建立快速、高通量的熒光檢測體系，使用GenAlEx6軟件進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。 結(jié)果：兩個(gè)STR位點(diǎn)的多態(tài)性均較高，其等位基因數(shù)在7-26之間，多態(tài)信息含量在0.43-0.90之間，有效等位基因數(shù)在2.040-10.449之間，雜合度在0.250-0.923之間。通過GenAlEx6軟件分別計(jì)算出了四個(gè)云麻品種之間的Nei’s遺傳距離，

14、然后使用UPGMA法繪制了云麻四個(gè)品種組成的系統(tǒng)聚類圖。 結(jié)論：所選CS1和ANIJCS305STR位點(diǎn)具有較高的遺傳多態(tài)性，若能開發(fā)出更多此類位點(diǎn)，并能采集較多不同來源地的標(biāo)本進(jìn)行分析建檔，以此建立起完整的全國大麻稀有等位基因數(shù)據(jù)庫和各品種間聚類系統(tǒng)樹，可使大麻品種間的鑒定成為可能，同時(shí)也能提高推斷毒品原植物大麻的來源地及其在實(shí)際案件的刑事鑒定上的應(yīng)用價(jià)值。 結(jié)論 本研究從新鮮大麻DNA提取及特異引物的篩選、特

15、殊大麻標(biāo)本DNA提取、特異的大麻性別位點(diǎn)、大麻STR位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性等幾個(gè)方面對毒品原植物大麻的DNA檢測技術(shù)進(jìn)行了的研究，建立了大麻DNA提取及檢測方法，對涉毒案件中毒品原植物的檢驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 1 本研究選用SDS法提取新鮮大麻植物標(biāo)本DNA，可以獲得高質(zhì)量的大麻基因組DNA。 2 本研究對所選擇的幾種提取特殊大麻標(biāo)本的方法進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)表明改良高鹽低pH方法最佳，得到了純度較高、片段較完整的大麻基因組DNA。并獲

16、得了10年以上大麻干葉及大麻樹脂的清晰凝膠電泳圖譜。 3 本研究自行設(shè)計(jì)的一對大麻雄性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到300～350bp大小的產(chǎn)物片斷，電泳檢出雄性大麻標(biāo)本的清晰譜帶，而未檢測到同樣條件擴(kuò)增的雌性大麻標(biāo)本和非大麻植物對照標(biāo)本的譜帶。 4 本研究對毒品原植物大麻的CS1和ANUCS305STR 兩個(gè)STR位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行了研究，并通過GenAlEx6軟件分別計(jì)算出了四個(gè)云南大麻品種之間的Nei’s遺傳距離，然后使用UP