篩選攜帶ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒載體.pdf

1、 目的：篩選能夠顯著抑制自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)陰莖海綿體平滑肌細胞內(nèi) Rho 關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶 2 ( Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2,ROCK2)基因表達的攜帶 siRNA 的慢病毒載體。方法：1.采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SHR陰莖海綿體平滑肌細胞。2.靶向大鼠ROCK2基因設(shè)計具有基因特異性的小干擾 RNA(small interferen

2、ce RNA,siRNA),構(gòu)建其短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA, shRNA)重組慢病毒表達載體。①設(shè)計RNAi 靶點序列并合成靶序列的 Oligo DNA,退火形成雙鏈 DNA,與經(jīng)Hpa I、XhoI進行酶切后的GP-Supersilencing Vector載體連接產(chǎn)生 shRNA 慢病毒載體。②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性菌落、擴增后提取質(zhì)粒,進行 DNA 測序鑒定。③GP-Supersilen

3、cing Vector與三種混合包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝產(chǎn)生shRNA 重組慢病毒。 3.隨機將5只SHR陰莖海綿體平滑肌細胞分為6組(每組n=5),每組每個樣本3×104個細胞,分別為：A組(未轉(zhuǎn)染對照組)、B組(攜帶慢病毒轉(zhuǎn)染組)、C~F組(分別攜帶靶向ROCK2基因的siRNA1~4號靶點的慢病毒轉(zhuǎn)染組),以MOI=80轉(zhuǎn)染SHR陰莖海綿體平滑肌細胞,轉(zhuǎn)染后48小時熒光顯微鏡下觀察細胞GFP表達情況,并用RT-PCR檢測各

4、組被轉(zhuǎn)染細胞ROCK2基因mRNA的表達。結(jié)果：1.經(jīng)酶切及基因測序鑒定證實重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.熒光顯微鏡下觀察各組細胞感染效率均大于 50%。3.RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后各組ROCK2 mRNA的表達：與A組相比,B組ROCK2基因mRNA的表達無明顯改變(P﹥0.05)；C組、D組、F組SHR陰莖海綿體平滑肌細胞ROCK2基因mRNA的表達較A組極顯著下降(P<0.01),抑制效率分別達到43.91±8.19℅、47