攜帶人Pax2、Sfrp2 干擾序列的慢病毒載體的構(gòu)建及靶細(xì)胞效應(yīng).pdf

1、目的: 構(gòu)建攜帶特定基因shRNA的慢病毒載體，感染靶細(xì)胞，成功整合小干擾片段入靶細(xì)胞中，為基因治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和研究方法。
　　 方法: 通過酶切鑒定pLVTHM（pLV）質(zhì)粒，使用Mlu I和Cal I雙酶切pLV，收獲載體目的片段并與相應(yīng)的shRNA(Pax2-human-shRNA、Sfrp2-human-shRNA)退火、加磷產(chǎn)物相連接，轉(zhuǎn)化Stbl2感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建的重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為pLV-Pax2-hum

2、an-shRNA、pLV-Sfrp2-human-shRNA，轉(zhuǎn)化后挑選單克隆擴(kuò)增進(jìn)行PCR鑒定，正確克隆送invitrogen公司測(cè)序鑒定。然后，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pLV-Pax2-human-shRNA、pLV-Sfrp2-human-shRNA和包裝質(zhì)粒NRF、包膜蛋白質(zhì)粒VSVG共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞(轉(zhuǎn)染pLV僅表達(dá)EGFP質(zhì)粒作為對(duì)照)，收獲病毒，測(cè)定滴度。通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法在體外提取、擴(kuò)增培養(yǎng)人骨髓間

3、充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，并鑒定hMSCs的純度。攜帶Akt1和兩種干擾基因的慢病毒重復(fù)感染293FT和hMSCs后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒感染效率，最終用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)Akt1、Pax2、Sfrp2的表達(dá)情況，并觀察其生物學(xué)效應(yīng)。
　　 結(jié)果: 通過PCR 和測(cè)序鑒定轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLV-Pax2-human-shRNA 、pLV-Sfrp2-human-shRNA構(gòu)建正確。包裝帶有人Pax2、Sfrp2

4、干擾序列的病毒并有效感染靶細(xì)胞，經(jīng)過熒光顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染率達(dá)80％以上,包裝后病毒滴度為6.2 × 105TU/ml 。RT-PCR 結(jié)果顯示pLV-Pax2-human-shRNA 、pLV-Sfrp2-human-shRNA可以成功下調(diào)293FT中Pax2、Sfrp2 mRNA的表達(dá)，效率分別約為86％和67％。hMSCs貼壁生長良好，呈旋渦狀、指紋狀，經(jīng)CD29、CD44、CD34、CD45等鑒定顯示純度大于90％

5、。攜帶人Pax2干擾序列的慢病毒感染過表達(dá)AKT1的hMSCs,有效下調(diào)Pax2的表達(dá)，通過RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，Sfrp2在過表達(dá)Akt1的293FT和MSCs中的產(chǎn)生通路是Akt1-Pax2-Sfrp2信號(hào)通路。還有研究結(jié)果顯示，攜帶人Sfrp2干擾序列的慢病毒感染過表達(dá)AKT1的hMSCs，通過下調(diào)Sfrp2蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞標(biāo)志性基因Nkx2.5、GATA4表達(dá)，表達(dá)率高達(dá)90％以上。
　

6、　 結(jié)論: 成功構(gòu)建帶有pLV-Pax2-human-shRNA、pLV-Sfrp2-human-shRNA干擾基因的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。包裝帶有干擾基因的慢病毒顆粒感染靶細(xì)胞，獲得干擾基因的表達(dá)，下調(diào)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。初步證實(shí)過表達(dá)AKT1的MSCs中SFRP2激活是通過AKT1-PAX2-SFRP2通路來實(shí)現(xiàn)的。初步摸索調(diào)節(jié)AKT1過表達(dá)hMSCs中SFRP2蛋白的表達(dá)，優(yōu)化其表達(dá)條件，促進(jìn)過表達(dá)AKT1的hMS