皮寒藥對金黃色葡萄球菌的抑制作用及其抑菌機(jī)制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為一種食源性致病菌，不僅嚴(yán)重威脅著食品衛(wèi)生安全，而且在動物生產(chǎn)上也具有嚴(yán)重的危害性。在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床上，金葡菌往往引起人類和動物化膿性感染。隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicilin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）臨床檢出率不斷升高，由其引起的感染現(xiàn)已成為全球性的衛(wèi)生難題。從天然藥物中尋找有效抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì)是近年來

2、抗菌藥物研發(fā)的一個(gè)方向。
　　皮寒藥是川滇米口袋（Gueldenstaedtia delavayi Franch）的干燥全草，《西昌中草藥》記載其：“全草入藥，四季可采；性寒，味辛苦，清熱解毒、鎮(zhèn)痛”，是四川攀西地區(qū)特色藥用資源，在當(dāng)?shù)卦撍幹饕糜谙飧屑膊?，具有藥食兩用的價(jià)值。迄今，對皮寒藥的研究報(bào)道較少，僅對其藥效學(xué)和活性成分進(jìn)行了部分研究。本課題通過提取分離皮寒藥不同部位藥物，以金黃色葡萄球菌為研究對象，篩選皮寒藥抑制金黃

3、色葡萄球菌生長的有效部位，并研究皮寒藥有效部位抗菌作用機(jī)理。主要試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1．皮寒藥幾種不同部位對金黃色葡萄球菌抑菌活性研究
　　利用有機(jī)溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分離提取皮寒藥不同部位，采用微量肉湯稀釋法測定皮寒藥不同部位對金葡菌質(zhì)控菌株ATCC25923和甲氧西林敏感金葡菌（Methicilin-susceptible Staphylococcu saureus，MSSA）臨床分離株RC-1、RC-3、

4、RC-5及耐甲氧西林金葡菌臨床分離株DZ-1的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果表明，皮寒藥正丁醇部位和水相部位對金葡菌生長無明顯影響。石油醚部位和乙酸乙酯部位均能不同程度抑制金葡菌質(zhì)控菌株和臨床分離株的生長，其 MIC分別為15 mg·mL-1和7.5 mg·mL-1，MBC分別為30 mg·mL-1和15 mg·mL-1，結(jié)果顯示皮寒藥乙酸乙酯部位具有更好的抑菌活性。通過對皮寒藥乙酸乙酯部位幾種不同濃度藥物下金葡菌

5、在不同時(shí)間點(diǎn)的菌落計(jì)數(shù)，繪制金葡菌的生長曲線，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1 MIC藥物組菌液濃度在2、4、6、10、24 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)極顯著低于菌液對照組和1/4 MIC藥物組（P＜0.01），在4、6、10、24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，極顯著低于1/2 MIC藥物組。1/2倍MIC藥物組菌液濃度在2、4、6、10 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)極顯著低于菌液對照組（P＜0.01），在2、4、6 h極顯著低于1/4 MIC組。1/4倍MIC藥物組菌液濃度在2、4、10 h三個(gè)時(shí)間

6、點(diǎn)顯著低于菌液對照組（P＜0.01）。結(jié)果提示：皮寒藥石油醚部位和乙酸乙酯部位能抑制MSSA和MRSA的生長，與石油醚部位相比，乙酸乙酯部位顯示出更好的抑菌活性，且抑菌效果與藥物濃度呈正相關(guān)。
　　2．皮寒藥乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理研究
　　通過測定金葡菌胞外堿性磷酸酶含量、培養(yǎng)液電導(dǎo)率、葡萄糖含量變化、糖代謝相關(guān)酶活及菌體可溶性蛋白含量變化，從皮寒藥乙酸乙酯部位對菌體細(xì)胞壁膜通透性、能量代謝、可溶性蛋白質(zhì)合成三

7、個(gè)方面研究藥物對金葡菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果顯示，MBC藥物濃度下，金葡菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率不發(fā)生變化，胞外堿性磷酸酶活性在藥物處理后1h和3h內(nèi)顯著高于菌液對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位對金葡菌細(xì)胞膜滲透性無影響，在藥物作用前期，可增大細(xì)胞壁的通透性。對葡萄糖含量變化測定結(jié)果顯示，1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC藥物濃度組培養(yǎng)液中所剩葡萄糖含量在4 h、6 h、8 h顯著高于0 MIC（P＜0.01）。0 MIC組金

8、葡菌在6 h內(nèi)消耗完培養(yǎng)液中的葡萄糖，而1/2 MIC和1/4 MIC組在10 h后消耗完畢，1 MIC組10 h后培養(yǎng)液中仍含有葡萄糖。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位的1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC三個(gè)藥物濃度能顯著抑制金葡菌對葡萄糖的利用。對糖代謝相關(guān)酶活的檢測結(jié)果顯示，在第1 h、3 h、5 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)1 MIC藥物組琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性均低于0 MIC組，其中乳酸脫氫酶活性在這兩組間差異極顯著（P＜0.01），

9、琥珀酸脫氫酶活性在第1 h和3 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位1 MIC濃度藥物可極顯著抑制金葡菌乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性。對金葡菌可溶性蛋白含量的檢測結(jié)果顯示，在3 h、5 h、7 h三個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)，1 MIC藥物組金葡菌可溶性蛋白濃度均低于菌液對照組，在3 h、5 h兩個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)差異極顯著（P＜0.01），在第7 h差異顯著（P＜0.05）。第3 h，1 MIC組菌體可溶性蛋白濃度比

10、菌液對照組降低了42.54%，第5 h降低了17.78%，第7 h降低了15.87%。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位1 MIC濃度藥物能抑制金葡菌可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果提示：皮寒藥乙酸乙酯部位能干擾金葡菌的能量代謝過程和可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)，在藥物作用前期能影響菌體細(xì)胞壁通透性。
　　3．皮寒藥乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　本研究通過對皮寒藥乙酸乙酯部位作用組和正常對照組的金葡菌轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行測序比

11、較，結(jié)果共獲得195個(gè)差異表達(dá)基因（FC≥2，P＜0.05），與對照組相比，皮寒藥作用組金葡菌轉(zhuǎn)錄本中101個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，94個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中皮寒藥作用組金葡菌的蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因：50S核糖體蛋白質(zhì)L27、50S核糖體蛋白質(zhì)L25、50S核糖體蛋白L15、核糖體RNA大亞基甲基轉(zhuǎn)移酶、延伸因子G基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。有14個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集在氨基酸生物合成過程，其中5個(gè)與天冬氨酸鹽家族氨基酸生物合成過程有關(guān)，基因

12、 lysC（編碼天冬氨酸激酶）、thrC（編碼蘇氨酸合酶）、metE（編碼同型半胱氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶）、dapH（編碼N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶）表達(dá)上調(diào)，基因lysA（編碼二氨基二庚酸脫羧酶）表達(dá)下調(diào)。嘌呤生物合成過程中，編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因、脫氧鳥苷激酶基因、甘氨酸連接酶基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，催化嘌呤核苷磷酸解反應(yīng)的嘌呤核苷磷酸化酶基因表達(dá)上調(diào)。此外，葉酸生物合成過程中聚谷氨酸合成酶、嘧啶代謝過程中的嘧啶核苷磷酸化酶基因均表達(dá)下調(diào)。

13、測序結(jié)果顯示差異基因在果糖-甘露糖代謝途徑存在顯著富集，果糖-二磷酸醛縮酶和L-艾杜糖醇-2-脫氫酶基因表達(dá)下調(diào)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族成員亞精胺/腐胺ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、寡肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵/鋅/錳/銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鎳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷壁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜通道蛋白基因表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞壁合成相關(guān)基因，mrcA（編碼青霉素結(jié)合蛋白1A）、murB（編碼UDP-N-乙酰胞壁酸脫氫酶）、sgtA（轉(zhuǎn)糖苷酶基因）、tagB（編碼磷壁酸生物合成蛋白質(zhì)）

14、表達(dá)上調(diào)。此外，多種毒力因子：表皮剝脫毒素A（Exfoliative toxin A）、凝集因子（Clumping factor）、殺白細(xì)胞素（Pantonvalentine leucocidin，PVL）以及與多糖細(xì)胞間黏附素（Polysaccharide intercellular adhesion，PIA）形成具有密切聯(lián)系的icaR、icaC基因均表達(dá)下調(diào)。以熒光定量PCR對10個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)變化

15、趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果基本一致。試驗(yàn)結(jié)果表明皮寒藥作用于金葡菌1 h，差異表達(dá)基因主要集中在代謝過程、催化活性、細(xì)胞過程、蛋白結(jié)合和毒力因子表達(dá)上。提示皮寒藥可下調(diào)金葡菌相關(guān)毒力因子的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響氨基酸代謝、糖代謝、嘌呤嘧啶代謝過程相關(guān)酶基因的表達(dá)，并可能通過下調(diào)金葡菌核糖體相關(guān)編碼基因及延伸因子的基因表達(dá)干擾菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成過程。
　　綜上，本研究表明皮寒藥乙酸乙酯部位對金葡菌具有抑菌和殺菌活性