P2X-NMDA受體參與經(jīng)顱直流電刺激對神經(jīng)病理性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由于中樞或者外周神經(jīng)病理性改變引起的頑固性疼痛，主要特征為自發(fā)性疼痛（spontaneous pain）、痛覺過敏(hyperagesia)及痛覺超敏(allo dynia)。臨床上，雖然藥物治療NPP已取得了較好的療效，但是由于NPP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，仍有部分病人疼痛控制效果不佳，長期大量使用藥物控制NPP可能會出現(xiàn)藥物的副作用或臟器功能的損害，并給患者帶來沉重

2、的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來基于神經(jīng)調(diào)控的介入治療被逐步應(yīng)用到各種頑固性疼痛的治療，并取得了理想的治愈效果。經(jīng)顱直流電刺激（Transcranial Direct Current Stimulationt，tDCS）是一種安全、無創(chuàng)、非侵入式的神經(jīng)調(diào)控新技術(shù)，利用微弱的直流電作用于顱骨表面特定的靶向區(qū)域，使大腦皮層發(fā)生可塑性的改變;已經(jīng)被證實(shí)可有效緩解纖維背痛、術(shù)后疼痛、脊髓損傷后疼痛等難治性疼痛。tDCS的鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不明確，但是其鎮(zhèn)痛效果受刺激

3、電極的極性、大小、刺激電極埋置的靶向位置等客觀因素的影響，同時(shí)也與患者的病程及刺激的干預(yù)次數(shù)等主觀因素有關(guān)，研究還發(fā)現(xiàn)谷氨酸、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)參與了tDCS對皮層的可塑性調(diào)控，抑制皮層NMDA受體可以削弱tDCS產(chǎn)生的后效應(yīng)。
　　P2X受體屬于嘌呤能離子通道型受體，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用。當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激時(shí)，大量ATP從受損神經(jīng)末梢釋放，與細(xì)胞膜上的P2X受體結(jié)合，引起陽離子大量內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞去極化，同時(shí)

4、P2X受體還通過與谷氨酸相互作用進(jìn)一步激活疼痛通路，許多研究證實(shí)谷氨酸NMDA受體活化與痛覺中樞敏感化的產(chǎn)生和維持有關(guān);在脊髓以上水平，尤其是在中樞NMDA受體和P2X3受體卻發(fā)揮著完全相反的作用，激活NMDA受體和P2X3受體可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。
　　中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray，PAG)是機(jī)體疼痛調(diào)制系統(tǒng)的重要位置，在上行調(diào)控的過程中參與將脊髓和延髓的傷害性信息投射至更高級中樞，同時(shí)還發(fā)出纖維參與高

5、位中樞對疼痛的下行調(diào)控，研究PAG腦區(qū)對疼痛信息的調(diào)控，有助于了解tDCS鎮(zhèn)痛的機(jī)制。推測tDCS通過刺激大腦皮層，促進(jìn)皮層神經(jīng)元可塑性改變，進(jìn)而投射至PAG并激活相關(guān)的下行抑制通路，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用;而NMDA受體和P2X3受體則參與了tDCS對皮層及PAG疼痛信息的加工。
　　本課題擬采用坐骨神經(jīng)縮窄性損傷模型(chronic constriction injury of sciatic nerve,CCI)為研究對象，建立tDC

6、S刺激模型，通過改變不同的刺激參數(shù)篩選tDCS治療病理性疼痛的最佳參數(shù)組合;在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用形態(tài)學(xué)、電生理以及行為學(xué)技術(shù)，研究PAG腦區(qū)P2X/NMDA受體在神經(jīng)病理性痛調(diào)控中的作用;通過在體行為學(xué)及離體電生理實(shí)驗(yàn)，研究P2X/NMDA受體參與tDCS鎮(zhèn)痛的機(jī)制。該研究對闡明神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制、提高tDCS鎮(zhèn)痛效率具有重要的意義。
　　方法：
　　1.建立SD大鼠神經(jīng)病理性疼痛(CCI)模型，通過Von Frey纖維絲和熱輻

7、射法檢測大鼠建模前后結(jié)扎側(cè)后肢機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化;
　　2.通過調(diào)整電極埋置位置（同側(cè)/對側(cè)）和電流極性（正極/負(fù)極）建立四種方式的tDCS治療模型，分別檢測單次和重復(fù)運(yùn)用這四種刺激方式對CCI大鼠結(jié)扎側(cè)后肢機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化，確定最佳的刺激方式;在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)檢測刺激強(qiáng)度、刺激時(shí)程以及介入時(shí)間點(diǎn)對CCI大鼠痛閾的變化，確定最佳的刺激參數(shù)組合;
　　3.通過免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡技術(shù)，觀察經(jīng)tDCS刺激后CCI

8、大鼠初級運(yùn)動皮層（primary motor cortex，M1）以及PAG腦區(qū)P2X3受體和NR2B受體表達(dá)分布以及蛋白水平變化;
　　4.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄正常大鼠PAG腦區(qū)神經(jīng)元在分別給予P2X3受體特異性激動劑α，β-亞甲基ATP(α,β-methylene-ATP，α,β-meATP)和特異性阻斷劑A-317491后神經(jīng)元興奮性的變化，觀察NMDA受體抑制劑MK-801對PAG神經(jīng)元興奮性變化的影響;觀察記錄CCI

9、大鼠在分別給予A-317491和MK-801后神經(jīng)元興奮性的變化;
　　5.制備vlPAG腦內(nèi)置管后的CCI大鼠模型，注射A-317491阻斷P2X3受體功能后，在PAG微量注射ATP的類似物α，β-meATP，觀察CCI大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化;注射MK-801阻斷NMDA受體功能后，在PAG微量注射α，β-meATP，觀察CCI大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化;
　　6.制備vlPAG腦內(nèi)置管后的tDCS大鼠模型，tDCS治

10、療結(jié)束后分別注射A-317491和MK-801，觀察CCI大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化，明確P2X3受體和NMDA受體對rDCS鎮(zhèn)痛作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1.成功制備CCI大鼠模型，該模型能夠較好的模擬慢性神經(jīng)病理性疼痛，觀察發(fā)現(xiàn)CCI大鼠機(jī)械痛閾及熱痛閾值較正常組大鼠降低，至術(shù)后14d達(dá)到最低值，其后痛閾值逐步恢復(fù)，痛行為逐步改善。
　　2.成功制備tDCS刺激模型，這種模型可以根據(jù)需求設(shè)置為陽極tDCS和陰極

11、tDCS。單次的陽極/陰極tDCS均可以引起CCI大鼠的機(jī)械痛閾及熱痛閾升高，同側(cè)陰極tDCS的鎮(zhèn)痛效果要優(yōu)于對側(cè)陽極tDCS，但是各組鎮(zhèn)痛效果在24h內(nèi)逐步消失;重復(fù)的陽極/陰極tDCS能有效地改善CCI術(shù)后所導(dǎo)致的痛行為，但是改善的效果及治愈率取決于tDCS相關(guān)各項(xiàng)參數(shù)，刺激時(shí)間越長、刺激的強(qiáng)度越大，tDCS所產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用就越好，且這種鎮(zhèn)痛作用的后效應(yīng)可以維持一周以上;對側(cè)陽極對CCI大鼠鎮(zhèn)痛的效果最穩(wěn)定。tDCS對痛閾的恢復(fù)還與

12、介入時(shí)間相關(guān)，介入時(shí)間越早、介入的次數(shù)越多，CCI大鼠疼痛的恢復(fù)程度就越好。
　　3.免疫組織化學(xué)和免疫印跡的結(jié)果顯示CCI術(shù)后14d，M1以及中腦vlPAG腦區(qū)P2X3受體以及NR2B陽性分布和蛋白表達(dá)與正常大鼠相比均有增加;陽極/陰極tDCS刺激后均可以引起CCI大鼠vlPAG以及M1腦區(qū)的P2X3和NR2B受體陽性表達(dá)和蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加。CCI術(shù)后14d，M1以及vlPAG區(qū)域GluR1受體表達(dá)增加，陽極/陰極tDCS刺激

13、后這兩個(gè)區(qū)域GluR1受體的表達(dá)及蛋白總量有所減少。
　　4.全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示α，β-meATP可使正常大鼠PAG神經(jīng)元興奮性顯著增強(qiáng)，應(yīng)用A-317194以及MK-801，均可使神經(jīng)元興奮性顯著降低。與正常大鼠相比較，CCI大鼠PAG神經(jīng)元的興奮性明顯增強(qiáng)，應(yīng)用A-317194和MK-801可抑制CCI大鼠PAG神經(jīng)元的興奮性。
　　5.vlPAG腦區(qū)微量注射A-317194后CCI大鼠損傷同側(cè)后肢的熱痛閾和機(jī)械性痛閾

14、均未發(fā)生明顯變化;給予α，β-meATP后CCI大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，α，β-meATP的鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性;PAG微量注射A-317491預(yù)處理后，α，β-meATP產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果被顯著削弱，機(jī)械痛閾和熱痛閾值與單獨(dú)使用α，β-meATP相比有所減少。
　　6.vlPAG腦區(qū)微量注射MK-801后CCI大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MK-801的鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有劑量依賴性和

15、時(shí)間依賴性;使用MK-801在PAG微量注射進(jìn)行預(yù)處理后，α，β-meATP產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果被顯著削弱，機(jī)械痛閾和熱痛閾值與單獨(dú)使用α，β-meATP相比有所減少。
　　7.vlPAG腦區(qū)微量注射MK-801和A-317491后，tDCS對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效果明顯下降，機(jī)械痛閾和熱痛閾值在一段時(shí)間內(nèi)明顯的減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.tDCS是一種有效的鎮(zhèn)痛手段，選擇合理的刺激參數(shù)可以提高的tDCS的鎮(zhèn)

16、痛效果，選擇損傷后肢對側(cè)的M1作為靶向區(qū)域進(jìn)行重復(fù)多次的陽極電刺激，可以達(dá)到最佳的鎮(zhèn)痛效果。
　　2.在PAG水平，P2X3受體具有鎮(zhèn)痛作用，抑制P2X3受體可以導(dǎo)致CCI大鼠的痛閾值下降，P2X3受體通過促進(jìn)谷氨酸NMDA受體表達(dá)增加發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
　　3.在PAG水平，NMDA受體具有鎮(zhèn)痛和致痛兩種作用，抑制NMDA受體可以導(dǎo)致CCI大鼠的痛閾值明顯增高，說明NMDA受體參與了中樞傷害性信息的加工;但是抑制NMDA受體又