存活素基因工程化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠心肌梗死的影響.pdf

1、目的：單純干細(xì)胞移植后極低的生存能力使其修復(fù)梗死心肌的作用十分有限，本研究旨在探討存活素(Survivin，SVV)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)離體和在體缺血微環(huán)境中的生存能力及其修復(fù)大鼠梗死心肌的作用及機(jī)制，為新的抗干細(xì)胞凋亡移植策略治療心肌梗死提供理論依據(jù)。 方法：1.分離幼年大鼠骨髓，采用貼壁法培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs，對連續(xù)傳代的第一(P1)、第二(P2)、第三代(P3)細(xì)胞進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)并描繪生長曲線，收集P3細(xì)胞

2、進(jìn)行流氏細(xì)胞儀技術(shù)鑒定；2.以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的p-FUGW慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介，采用體外重組(infusion)技術(shù)構(gòu)建攜帶SVV基因重組慢病毒表達(dá)載體(p-FUGW-SVV)，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶切和測序的方式鑒定所構(gòu)建的載體；以脂質(zhì)體包裝SW重組慢病毒和空病毒(作為實(shí)驗(yàn)對照)，采用倍比稀釋法測定病毒滴度，以感染復(fù)數(shù)(MOI)2、8、32的病毒感染P1 BMSCs，以空病毒作為對照，采用Western

3、-blot法檢測不同滴度感染的BMSCs SVV蛋白表達(dá)；3.將感染的P1 BMSCs傳代至P3，采用流氏細(xì)胞儀技術(shù)定量檢測GFP陽性細(xì)胞數(shù)比例；模擬在體缺血微環(huán)境，建立無血清饑餓刺激凋亡誘導(dǎo)模型，將按上述最佳感染條件SVV重組病毒和空病毒處理過的P3BMSCs(分別稱為SVV/GFP+BMSCs組和GFP+BMSCs組)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)以為未感染的P3 BMSCs作為對照(BMSCs組)，采用流氏細(xì)胞儀技術(shù)定量檢測無血清培養(yǎng)0

4、h、12h、24h、48h、72h的細(xì)胞凋亡；4.采用冠脈結(jié)扎法建立大鼠心肌梗死模型，72只大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、溶劑對照組[vehic組，僅注射100ul磷酸鹽緩沖液(PBS)]、空病毒感染的BMSCs移植組(GFP+BMSCs組)和SVV重組慢病毒感染的BMSCs移植組(SVV/GFP+BMSCs組)，以2×106個(gè)細(xì)胞/只的細(xì)胞數(shù)注入梗死區(qū)心肌，每組再按梗死后7天、14天、28天分為3個(gè)亞組(每組6只)，以激光共聚焦掃描顯微鏡觀

5、察移植細(xì)胞存活情況，采用多重免疫熒光染色技術(shù)評價(jià)移植細(xì)胞分化；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測梗死區(qū)心肌組織成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)mRNA表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測bFGF、HGF蛋白表達(dá)及WeNern-blot檢測VEGF蛋白表達(dá)；伊紅.蘇木素(HE)染色評價(jià)細(xì)胞移植后心肌病理變化；采用免疫組織化學(xué)法檢測假性血友病因子(vWF)的表達(dá)以評價(jià)細(xì)胞移植后28天毛細(xì)血管生成

6、；麥松(Masson)染色檢測細(xì)胞移植后28天心肌膠原纖維變化，以及采用二次諧波(SHG)成像技術(shù)探測梗死區(qū)SHG峰值信號定量評價(jià)膠原沉積；采用數(shù)字高幀頻超聲心動圖觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組心功能變化。 結(jié)果：1.從P1至P3， BMSCs增殖活力逐漸減低，傳至P3時(shí)，大鼠BMSCs基本表達(dá)CD29、CD44、CD90，而不表達(dá)CD14、CD34.、CD45。2.采用Infusion技術(shù)構(gòu)建的SVV重組慢病毒表達(dá)載體經(jīng)PCR、酶切及測序

7、鑒定完全正確，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞能夠正確表達(dá)。3.所包裝的SVV重組病毒經(jīng)濃縮后滴度為1.5×108TU/ml，倒置相差熒光顯微鏡下，感染大鼠BMSCs發(fā)出綠色熒光，熒光強(qiáng)度隨MOI值的增加而增強(qiáng)，所表達(dá)的SVV蛋白呈現(xiàn)SVV/GFP融合蛋白和SVV蛋白單體兩種形式，其中，但以MOI為8的病毒感染大鼠BMSCs，SW蛋白單體表達(dá)最強(qiáng)。4.以MOI為8的病毒感染P1 BMSCs四天后，無論是SVV重組病毒還是空病毒感染的細(xì)胞均基本表達(dá)G

8、FP，且兩組細(xì)胞傳至P3時(shí)GFP陽性細(xì)胞均達(dá)95％以上。GFP+BMSCs和SVV/GFP+BMSCs均隨著無血清刺激時(shí)間的延長凋亡細(xì)胞逐漸增加，但后者明顯少于前者(P<0.05)，尤以72h最為明顯，凋亡細(xì)胞降低了近25％，GFP+BMSCs組與未感染的BMSCs組相比各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異(P>0.05)。在體內(nèi)，移植后7天，SVV/GFP+BMSCs組存活細(xì)胞的數(shù)量是GFP+BMSCs組的3倍多，而28天時(shí)接近6倍，除少許移植細(xì)胞

9、與宿主心肌細(xì)胞融合外未見明顯分化為心肌樣細(xì)胞的現(xiàn)象；SW/GFP+BMSCs組梗死區(qū)bFGF、HGF、VEGF表達(dá)明顯上調(diào)，與vehic組和GFP+BMSCs組相比，差異顯著(P<0.01)，而GFP+BMSCs組僅于移植后7天時(shí)高于vehic組(P<0.05)。SW/GFP+BMSCs組梗死區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤和瘢痕化明顯輕于vehi c組和GFP+BMSCs組；移植后28天，SVV/GFP+BMSCs組梗死區(qū)毛細(xì)血管密度明顯增加，約比GF

10、P+BMSCs組多27.7％(P<0.01)，而且前者膠原沉積明顯輕于后者(P<0.01)；GFP+BMSCs移植對心功能的改善表現(xiàn)為從移植后14天開始，并且改善程度有限；而SW/GFP+BMSCs移植對心功能的保護(hù)作用更早(從7天開始)，至28天時(shí)，心功能幾乎與假手術(shù)組相當(dāng)(P>0.05)。 結(jié)論：SVV基因修飾能夠增強(qiáng)大鼠BMSCs在缺血缺氧微環(huán)境中的生存能力，移植該基因工程化BMSCs能夠進(jìn)一步保護(hù)大鼠心肌梗死后的心功能，